IDENTIFIKASI TAHAP PERKEMBANGAN MIKROSPORA DAN INDUKSI KALUS TANAMAN SORGUM [Sorghum bicolor (L.) Moench] MELALUI KULTUR ANTERA

Abstract

Sorgum [Sorghum bicolor (L.) Moench] merupakan salah satu tanaman sereal penting yang banyak dikonsumsi setelah gandum, jagung, padi dan barley. Perbaikan genetik sorgum telah diupayakan untuk memperbaiki sifat-sifat tanaman agar dapat memenuhi permintaan akan bahan makanan, pakan dan bahan bakar dari populasi dunia yang berkembang pesat. Proses pemuliaan tanaman sorgum secara konvensional memerlukan waktu yang lama dan biaya yang besar, oleh karena itu diperlukan metode yang dapat mempercepat perolehan galur murni untuk pengembangan varietas tanaman yang unggul. Teknologi doubled haploid (DH) dikenal sebagai metode yang bermanfaat dalam pemuliaan tanaman karena berpotensi mempercepat program pemuliaan tanaman dengan mempersingkat siklus pemuliaan varietas melalui fiksasi kombinasi gen yang diinginkan. Salah satu metode produksi tanaman DH yang umum digunakan yaitu melalui kultur antera. Informasi mengenai tahap perkembangan mikrospora perlu diketahui sebelum antera dikulturkan. Tahap perkembangan mikrospora berpengaruh terhadap respons pada induksi kalus dan regenerasi tanaman dari kultur antera. Penggunaan zat pengatur tumbuh (ZPT) pada media induksi dan regenerasi sangat penting untuk diketahui dalam mendukung keberhasilan androgenesis. Karakterisasi morfologi tanaman sorgum juga penting untuk diamati sebagai kelengkapan informasi sebelum genotipe tertentu dimanfaatkan dalam kegiatan pemuliaan tanaman. Tujuan umum penelitian ini yaitu sebagai upaya untuk memperoleh informasi awal dan pengembangan protokol dalam merakit tetua galur murni tanaman sorgum secara in vitro. Sampai saat ini, sistem yang komprehensif dan efisien masih sulit diperoleh, meskipun kultur jaringan sorgum telah dipelajari selama beberapa dekade. Oleh karena itu, penelitian ini penting dilakukan untuk meningkatkan keberhasilan kultur antera sorgum. Penelitian ini terdiri atas tiga percobaan. Percobaan pertama bertujuan untuk memperoleh informasi mengenai karakter morfologi dan fenologi beberapa genotipe tanaman sorgum pada fase generatif. Materi genetik yang digunakan yaitu Bioguma 1, Kawali, Soper 6 dan Samurai 2. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor dimana genotipe merupakan faktor perlakuan. Setiap perlakuan terdiri atas 3 ulangan. Pengamatan karakter kualitatif dan kuantitatif dilakukan pada empat genotipe sorgum (Bioguma 1, Kawali, Soper 6 dan Samurai 2) pada fase generatif kemudian dilakukan analisis uji F. Hasil penelitian menunjukkan adanya perbedaan karakter morfologi yaitu tinggi tanaman, panjang malai, panjang spikelet dan lebar spikelet dan karakter fenologi tanaman sorgum, seperti umur fase bunting, waktu muncul malai, umur berbunga 50%. Percobaan kedua bertujuan untuk mengidentifikasi karakter morfologi bunga dan tahap perkembangan mikrospora pada antera sorgum selama fase bunting untuk mendapatkan tahap perkembangan mikrospora yang tepat pada kultur antera. Pengamatan dilakukan pada empat genotipe sorgum (Bioguma 1, Kawali, Soper 6 dan Samurai 2). Malai sorgum diklasifikasikan menjadi tiga bagian berdasarkan posisi spikelet pada malai yaitu apikal, tengah dan basal. Ukuran (panjang dan lebar) spikelet dan antera pada masing-masing genotipe diukur, kemudian dilakukan analisis uji F. Identifikasi tahap perkembangan mikrospora dilakukan pada antera dari sessile spikelet yang diambil dari malai sorgum saat fase bunting hari ke-1 sampai ke-5. Pengamatan dilakukan pada empat bidang pandang untuk masing-masing sampel dari ke empat genotipe dan proporsi mikrospora dihitung pada masing-masing sampel. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor yaitu genotipe. Setiap percobaan terdiri atas 3 ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan spikelet dan antera (panjang dan lebar) seiring dengan pertambahan hari selama fase bunting berlangsung. Tahap perkembangan mikrospora seiring dengan pertumbuhan ukuran spikelet dan antera, dimana seluruh genotipe menunjukkan proporsi tahap perkembangan mikrospora yang berbeda pada ke-tiga posisi antera dari sessile spikelet (apikal, tengah dan basal) pada malai selama fase bunting (5 hari). Berdasarkan persentase proporsi mikrospora dominan, antera yang mengandung mikrospora tahap awal uninukleat dengan proporsi > 83% terdapat pada antera dari sessile spikelet bagian apikal malai yang diambil pada fase bunting hari ke-2 dengan karakteristik yaitu jarak antara dasar daun bendera dengan daun di bawahnya (6 – 10 cm), panjang spikelet (4,87 - 5,60 mm) dan antera (1,37 - 2,00 mm), serta lebar spikelet (1,2 - 2,3 mm) dan antera (0,3 - 0,4 mm). Percobaan ketiga bertujuan untuk menganalisis respon tanaman sorgum dari beberapa genotipe (Bioguma 1, Kawali, Soper 6 dan Samurai 2) terhadap induksi kalus dan regenerasi tanaman dan pengaruh putresin dalam meningkatkan keberhasilan induksi kalus dan regenerasi tanaman hijau pada kultur antera sorgum. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap faktorial. Terdapat dua faktor perlakuan yaitu genotipe sorgum (Bioguma 1, Kawali, Soper 6 dan Samurai 2) dan media kultur [P0 atau kontrol (media induksi kalus MS dan media regenerasi MS); P1 (media induksi kalus MS + putresin 10-3 M dan media regenerasi MS); P2 (media induksi kalus MS dan media regenerasi MS + putresin 10-3 M); P3 (media induksi kalus MS + putresin 10-3 M dan media regenerasi MS + putresin 10-3 M)]. Setiap perlakuan terdiri atas 20 ulangan. Sebelum dikulturkan, malai sorgum diberi pra-perlakuan suhu dingin 4 ± 5°C selama 8 hari. Kalus yang tumbuh dengan ukuran > 1 mm dipindahkan ke media regenerasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa antera dengan tahap perkembangan mikrospora awal uninukleat dapat digunakan untuk menginduksi kalus sorgum melalui kultur antera. Tingkat keberhasilan induksi kalus sorgum dipengaruhi oleh genotipe. Bioguma 1 merupakan genotipe dengan persentase antera menghasilkan kalus tertinggi dengan total persentase mencapai 9,69%, sementara Samurai 2 menunjukkan persentase antera menghasilkan kalus terendah dengan total persentase mencapai 3,67%. Hasil pengamatan pada perlakuan regenerasi tanaman menunjukkan bahwa kalus dari seluruh genotipe pada semua jenis komposisi media tidak dapat beregenerasi membentuk planlet atau tanaman baru. Penambahan putresin 10-3 M pada media induksi dan regenerasi tidak efekif dalam meningkatkan pertumbuhan kalus dan regenerasi kalus membentuk planlet.

Sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] is a C4 plant and the world’s fifth-largest cereal crop, consumed in the world after rice, wheat, maize, and barley. Genetic improvement of sorghum has been attempted to enhance plant traits and meet the demand for food, feed, and fuel from a rapidly growing world population. The conventional sorghum breeding process is time-consuming and costly. Therefore, technology is needed to accelerate the attainment of a pure line in order to develop superior sorghum plant varieties. Doubled haploid (DH) technology is known as a useful method in plant breeding since it has the potential to speed up plant breeding programs by shortening the variety breeding cycle through fixation of desired gene combinations. One of the methods which commonly used to produce DH plants is through anther culture. Information regarding the development stages of microspores needs to be known before anthers are cultured. The stage of microspore development influences the response to callus induction and plant regeneration from anther culture. The use of plant growth regulators (PGR) in induction and regeneration media is important in supporting the success of androgenesis. Morphological characterization of sorghum plants is also crucial to observe as complete information before certain genotypes are used in plant breeding activities. The general objective of this research is to obtain initial information and develop a protocol for the development of sorghum pure lines in vitro. Up to this present time, a comprehensive and efficient system has been difficult to obtain, although sorghum tissue culture has been studied for decades. Therefore, this research is important to carry out to increase the success rate of sorghum anther culture. This research consisted of three experiments. The objective of the first experiment was to obtain information on morphological characters and phenological characteristics of several sorghum genotypes in the generative phase. The genetic material used was Bioguma 1, Kawali, Soper 6, and Samurai 2. This experiment used a single-factor completely randomized design where genotype was the treatment factor. Each treatment consisted of 3 replications. Qualitative and quantitative character observations were carried out on four sorghum genotypes (Bioguma 1, Kawali, Soper 6, and Samurai 2) in the generative phase, then an F-test analysis was carried out. The study's results revealed differences in morphological characters, including plant height, panicle length, spikelet length, and spikelet width, as well as phenological characters of sorghum plants, namely the age of the booting stage, time of panicle emergence, and age at 50% flowering. The second experiment aimed to identify the morphological characteristics of flowers and the developmental stages of microspores in sorghum anthers during the booting stage to obtain the appropriate microspore developmental stages for anther culture. Observations were conducted on four sorghum genotypes (Bioguma 1, Kawali, Soper 6, and Samurai 2). Sorghum panicles were classified into three parts based on the position of the spikelets on the panicles, namely apical, middle, and basal. The size (length and width) of spikelets and anthers in each genotype was measured, and then an F-test analysis was carried out. Identification of microspore development stages was carried out on the anthers of sessile spikelets taken from sorghum panicles on days 1 to 5 of the booting stage. Observations were carried out in four fields of observation for each sample from the four genotypes, and the proportion of microspores in each sample was calculated. This experiment used a completely randomized design with a single factor, namely genotype. Each experiment consisted of 3 replications. The results showed that the growth (length and width) of spikelets and anthers was in line with the increase in days during the booting stage. The development stage of microspores was in line with the growth of spikelet and anther size, where all genotypes show different proportions of microspore development stages in the three anther positions of the sessile spikelet (apical, middle, and basal) on the panicle during the booting stage (5 days). Based on the percentage of dominant microspores, anthers containing early uninucleate stage microspores with a proportion of > 83% were found in the anthers of the sessile spikelets of the apical part of the panicle taken at the 2nd day of booting stage with the following characteristics: the distance between the base of the flag leaf and the leaf below (6 - 10 cm), spikelet length (4.87 - 5.60 mm) and anther (1.37 - 2.00 mm), and spikelet width (1.2 - 2.3 mm) and anther (0.3 - 0.4 mm). The third experiment aimed to analyze the response of sorghum plants from several genotypes (Bioguma 1, Kawali, Soper 6, and Samurai 2) to callus induction and plant regeneration, and the effect of putrescine in increasing the success of callus induction and green plant regeneration in sorghum anther culture. This experiment used a factorial completely randomized design. There were two treatment factors, i.e., sorghum genotype (Bioguma 1, Kawali, Soper 6, and Samurai 2) and culture media [P0 or control (MS callus induction media and MS regeneration media); P1 (MS callus induction media + putrescine 10-3 M and MS regeneration media); P2 (MS callus induction media and MS regeneration media + putrescine 10-3 M); P3 (MS callus induction media + putrescine 10-3 M and MS regeneration media + putrescine 10-3 M)]. Each treatment consisted of 20 replications. Before culturing, sorghum panicles were pre-treated at a cold temperature of 4 ± 5°C for 8 days. Callus (> 1 mm) was transferred to regeneration media. The results showed that anthers with early uninucleate microspore development stages could be used as planting material to induce sorghum callus through anther culture. The genotype influenced the success rate of sorghum callus induction. Bioguma 1 is the genotype with the highest percentage of anthers producing callus of the other three genotypes, reaching 9.69%. While Samurai 2 showed the lowest rate of anthers producing callus, with a total percentage reaching 3.67%. The results of observations on plant regeneration showed that callus from all genotypes, regardless of media composition, could not regenerate to form plantlets or new plants. The addition of 10-3 M putrescine to the induction and regeneration media was not effective in increasing callus growth and callus regeneration to form plantlets.