Optimasi produksi prekursor insulin rekombinan secara heterologous oleh khamir Pichia pastoris dalam bioreaktor 10 L

Abstract

Diabetes adalah penyakit metabolik dimana insulin tidak berfungsi sebagaimana mestinya dikarenakan terjadinya gangguan pada sekresi insulin, kerja insulin atau keduanya. Salah satu terapi pasien diabetes adalah insulin. Adanya tren peningkatan jumlah pasien diabetes dan pasar penjualan insulin secara global mendorong pengembangan teknologi produksi insulin pada skala besar. Ekspresi insulin secara heterologus pada sel mikrob, seperti khamir Pichia pastoris, menjadi salah satu strategi untuk ketercapaian produksi skala besar. Salah satu galur yang dirancang untuk ekspresi prekursor insulin rekombinan (PI) adalah klon 4 P. pastoris X33 yang membawa gen prekursor insulin manusia dalam plasmid pD902-IP (CL4). Galur ini dapat mengekspresikan prekursor insulin pada skala kultur kocok dan bioreaktor 2 L, hanya saja ekpresinya pada bioreaktor 10 L sebagai model untuk produksi skala industri belum dilakukan. Purifikasi prekursor insulin yang dihasilkan oleh galur tersebut juga sudah dilakukan, dengan perolehan kembali produk sekitar 90%, tetapi kemurniannya belum dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi optimal produksi PI pada bioreaktor 10 L dan pemurnian PI dengan perolehan kembali produk diatas 90%. Selain itu juga untuk membandingkan kinetika pertumbuhan P. pastoris antara proses sebelum dan setelah optimasi produksi. Secara garis besar studi ini terbagi menjadi tiga bagian, yaitu (1) karakterisasi kinetika pertumbuhan CL4 dan peningkatan skala kultivasinya di bioreaktor 10 L, (2) peningkatan jumlah PI dengan melakukan optimasi kultivasi di bioreaktor 10 L, dan (3) pemilihan metode pemurnian terbaik untuk memisahkan PI dari supernatan hasil kultivasi CL4 di bioreaktor 10 L. Bagian pertama bertujuan untuk melakukan karakterisasi pertumbuhan CL4 dan meningkatkan skala kultivasinya dari bioreaktor 2 L menjadi 10 L. Karakterisasi dilakukan dengan menghitung laju pertumbuhan maksimal CL4 dan membandingkan dengan laju pertumbuhan wild type (WT) sekaligus mengkonfirmasi ekspresi PI oleh CL4. Laju pertumbuhan spesifik CL4 lebih besar dari WT pada media dengan sumber karbon glukosa atau gliserol, tetapi pertumbuhan CL4 lebih kecil dari WT pada media dengan sumber karbon metanol. Peningkatan skala produksi dimulai dengan melakukan kultivasi CL4 di bioreaktor 10 L dengan menggunakan parameter proses pada bioreaktor 2 L yang diaplikasikan pada bioreaktor 10 L (A0) kemudian menghitung kinetika prosesnya. Massa PI yang didapatkan dengan peningkatan skala bioreaktor (A0) adalah 0,85 g, lebih besar 1,9 kali dari massa PI yang didapatkan dari bioreaktor 2 L (0,445 g) sedangkan biomassa yang dihasilkan proses A0 adalah 72 g/L. Bagian kedua bertujuan untuk meningkatkan jumlah produksi PI dengan melakukan optimasi kultivasi di bioreaktor 10 L. Dari hasil evaluasi proses A0 dilakukan optimasi dengan mengubah strategi pemberian metanol dari berkala menjadi berkelanjutan (A1-A2), menambahkan fase fed-batch gliserol (A3-A4) dan menggunakan sorbitol sebagai campuran induser metanol (A5-A6-A7). Biomassa CL4 meningkat dari 60 g dry cell weight (DCW)/L menjadi 167,3 g DCW/L dengan penambahan fed-batch gliserol. Produksi PI CL4 meningkat dari 0,4 g/L menjadi 2,5 g/L melalui strategi bioproses batch gliserol dan fed-batch metanol berkelanjutan. Rasio 20:1 C-mol metanol/C-mol sorbitol menghasilkan PI CL4 1,4 kali lebih besar (1,3 g/L) dari strategi fed-batch metanol murni (0,9 g/L) pada kultivasi selama 173 jam dengan batch gliserol. Massa PI yang didapatkan dari optimasi kultivasi (A1-A7) adalah 2 hingga 12 g. Hasil ini lebih besar 2,4 hingga 23,5 kali dari kultivasi A0. Laju pertumbuhan optimal CL4 pada proses A0 adalah yang terbesar dari semua proses, sedangkan produktivitas spesifik maksimalnya berada pada rentang nilai A1-A7. Laju pertumbuhan maksimal CL4 di gliserol untuk A0 hingga A7 lebih besar dari lajunya di metanol. Produktivitas A1-A7 lebih baik daripada A0. Karakteristik CL4 berbeda dengan mikrob produsen prekursor insulin manusia yang dilaporkan sebelumnya. Bagian ketiga bertujuan untuk mendapatkan metode pemurnian terbaik untuk memisahkan PI dari supernatan hasil kultivasi CL4 di bioreaktor 10 L dengan melakukan optimasi. Optimasi purifikasi dilakukan dengan 3 metode yaitu pengendapan PI oleh ZnCl2-fenol, kromatografi kolom menggunakan resin pertukaran kation (cation exchange chromatography (CEC)) dan gabungan ZnCl2-fenol dengan CEC. Konsentrasi fenol yang digunakan pada metode pengendapan, cara ekuilibrasi kolom, komposisi bufer, cara dan perbandingan pengenceran sampel dengan bufer pada metode CEC, dan gabungan metode pengendapan dan CEC merupakan metode yang berbeda dengan studi sebelumnya. Metode pengendapan PI dengan konsentrasi fenol 0,4% (v/v) dan 0,8% (v/v) dan CEC dengan bufer asetat pH 4 dan sitrat pH 3 menghasilkan perolehan kembali PI sebesar 56,4%-92,4% dengan kemurnian PI sebesar 90,1-98,7%. Perolehan kembali PI dengan kemurnian PI tertinggi (masing-masing 92,4% dan 98,7%) dicapai pada metode CEC dengan ekuilibrasi kolom 14 CV, pengenceran sampel 9:70 (supernatan CL4: bufer ekuilibrasi 20 mM natrium asetat pH 4). Optimasi ini meningkatkan perolehan kembali dan kemurnian PI diatas 90%. Berdasarkan uraian tersebut, kebaruan dari penelitian ini adalah (1) Penerapan strategi bioproses batch gliserol, fed-batch gliserol dan fed-batch metanol berkelanjutan yang mampu meningkatkan biomassa khamir rekombinan P. pastoris X33 pD902-1P klon 4 (CL4) dari 60 g DCW/L menjadi 167,3 g DCW/L (2) Peningkatan produksi PI CL4 dari 0,4 g/L menjadi 2,5 g/L melalui strategi bioproses batch gliserol dan fed-batch metanol berkelanjutan (3) Strategi fed-batch metanol-sorbitol dengan rasio 20:1 C-mol metanol/C-mol sorbitol yang menghasilkan PI CL4 1,4 kali lebih besar (1,3 g/L) dari strategi fed-batch metanol murni (0,9 g/L) pada kultivasi selama 173 jam dengan batch gliserol (4) Pengembangan strategi purifikasi berbasis CEC buffer 20 mM natrium asetat dengan ekuilibrasi kolom 14 CV dan rasio pengenceran supernatan CL4:bufer ekuilibrasi = 9:70 yang mampu mendapatkan nilai perolehan kembali PI hingga 92,4% dengan tingkat kemurnian 98,7%.