Variasi DNA Mitokondria Lebah Madu Hutan Apis dorsata Asal Kepulauan Indonesia

Abstract

Asia memiliki sejarah geologi dan biogeografi yang kompleks. Pengaruh pergeseran lempeng tektonik, perubahan iklim global, dan fluktuasi muka laut berperan dalam sejarah geologi dan biogeografi Asia. Indonesia sebagai salah satu negara di Asia terletak di zona konvergensi tiga lempeng utama dunia (Eurasia, Indo-Australia, dan Pasifik). Indonesia terbagi menjadi tiga wilayah biogeografi utama, yaitu Paparan Sunda, Wallacea, dan Paparan Sahul. Wilayah Wallacea diketahui memiliki tingkat endemisme yang tinggi akibat isolasi geografis antara dua paparan besar. Salah satu fauna yang mencerminkan dinamika biogeografi ini adalah lebah madu hutan Apis dorsata yang tersebar luas di Asia. Spesies ini ditemukan dari wilayah barat (Paparan Sunda) hingga timur (Kepulauan Kei). Dua dari tiga subspesies A. dorsata yang ada di dunia dapat dijumpai di Indonesia. Apis dorsata dorsata tersebar luas kecuali di Sulawesi. Subspesies lainnya A. dorsata binghami merupakan lebah madu hutan endemik Sulawesi dan sekitarnya. Keduanya dapat dibedakan secara morfologi serta memiliki perbedaan genetik yang dapat diungkap melalui analisis DNA mitokondria (DNA mt). Studi molekuler menunjukkan adanya variasi genetik yang tinggi terutama di wilayah-wilayah yang terisolasi secara geografis. Empat garis keturunan A. dorsata telah terungkap sebelumnya. Hasil tersebut belum menjelaskan keanekaragaman genetik di kawasan Indonesia khususnya Paparan Sunda, Sunda Kecil, dan Sulawesi yang diperkirakan menyimpan haplotipe spesifik yang penting dalam konservasi dan pemahaman evolusi spesies ini. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah menganalisis variasi genetik A. dorsata asal Kepulauan Indonesia menggunakan gen cytochrome c oxidase subunit 1 (COI), cytochrome c oxidase subunit 2 (COII), dan daerah non-coding intergenic spacer (igs) COI/COII DNA mt. Tiga puluh satu koloni A. d. dorsata dan dua koloni A. d. binghami yang digunakan merupakan koleksi tim Prof. Dr. Rika Raffiudin dari sembilan provinsi pada delapan pulau. DNA diekstrak berdasarkan protokol Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) yang telah dimodifikasi. DNA diamplifikasi dengan PCR dan dilanjutkan proses sekuen DNA dengan gen target COI dan igs-COII. Hasil sekuen dianalisis menggunakan BLAST-N, DnaSP 5.1, Network versi 10.2.0.0, Genetyx Win versi 4.0, dan MEGA X. Hasil sekuen gen COI, COII, dan igs berturut-turut adalah 635, 445, dan 24-25 pb. Sekuen tersebut telah didepositkan pada GenBank dengan nomor aksesi COI (LC830603-LC830668) dan igs-COII (LC845062-LC845127). Tiga puluh tiga, 37, dan satu mutasi insersi delesi berturut-turut terjadi pada A. dorsata asal Kepulauan Indonesia berdasarkan gen COI, COII, dan igs. Variasi tersebut membentuk 14 haplotipe COI dan 15 haplotipe COII yang 13 diantaranya merupakan haplotipe baru. Haplotipe Sumatra1 merupakan haplotipe umum A. dorsata Indonesia yang dominan ditemukan di wilayah Paparan Sunda khususnya Sumatra. Wilayah Wallacea (Sunda Kecil dan Sulawesi) cenderung membentuk haplotipe spesifik setiap pulau sehingga jarang ditemukan haplotipe umum pada kawasan tersebut. iii Subspesies endemik Sulawesi, A. d. binghami, menunjukkan satu haplotipe spesifik COI dan tiga pada COII dengan tingkat variasi nukleotida yang tinggi. Variasi insersi delesi sekuen igs ditemukan pada subspesies asal Sulawesi. Variasi tesebut dapat menjadi pembeda antara A. d. dorsata dan A. d. binghami. Variasi nukleotida juga dapat menyebabkan perubahan asam amino. Variasi yang terjadi pada haplotipe Sumatra2 menyebabkan satu-satunya perubahan asam amino gen COI A. dorsata. Berdasarkan gen COII, ditemukan 24 perubahan asam amino pada A. dorsata dan sembilan diantaranya milik subspesies A. d. binghami. Penelitian ini menemukan dua variasi nukleotida spesifik A. d. binghami yang menyebabkan perubahan asam amino. Variasi tersebut dapat menjadi penanda molekuler bagi A. d. binghami. Apis dorsata asal Paparan Sunda menunjukkan keanekaragaman dan diferensiasi genetik yang lebih rendah dibandingkan lebah madu hutan lainnya asal Sunda Kecil dan Sulawesi. Hal ini ditunjukkan dari rendahnya ragam nukleotida (?) dan haplotipe (Hd) terutama pada populasi dari Belitung dan Jawa. Menariknya, lebah asal Sumatra Selatan menunjukkan keragaman tertinggi karena dijumpai haplotipe spesifik di setiap lokasi koloni. Analisis fixation index (FST) juga menunjukkan diferensiasi genetik yang rendah pada A. dorsata asal Paparan Sunda dibandingkan wilayah Wallacea. Beberapa populasi seperti Jambi dan Belitung bahkan menunjukkan homogenitas genetik (FST negatif). Namun, wilayah Sunda Kecil dan Sulawesi menunjukkan tingkat diferensiasi yang lebih tinggi. Analisis Median-Joining Network (MJ network) dan filogenetik Maximum Likelihood (ML) berdasarkan gen COI, COII, dan gabungan COI-igs-COII A. dorsata menunjukkan hasil yang konsisten. Hasil ini mengidentifikasi tiga kelompok utama lebah madu hutan asal Indonesia berdasarkan geografinya: (a) A. d. dorsata Paparan Sunda (Sumatra, Belitung, Jawa, dan Lombok); (b) A. d. dorsata Sunda Kecil (Sumbawa, Flores, Sermata-Maluku Barat Daya); serta (c) A. d. binghami Sulawesi yang menempati posisi basal dari lebah madu hutan lainnya. Hal tersebut menunjukkan status evolusioner A. d. binghami yang lebih terpisah. Haplotipe Sumatra1 teridentifikasi sebagai nenek moyang (haplotipe leluhur) yang menyebar ke wilayah lain. Populasi asal Sunda Kecil dan Sulawesi membentuk kelompok terpisah dari Paparan Sunda. Temuan ini memperkuat hipotesis adanya isolasi geografis, diferensiasi evolusioner, serta kemungkinan spesiasi di Kawasan Wallacea. Penelitian ini berhasil membentuk database dan menunjukkan bahwa penggunaan gen COI, COII, dan igs DNA mt dapat mengungkap tiga kelompok genetik serta asal usul nenek moyang persebaran lebah madu hutan yang ada di Indonesia. Hasil ini dapat berkontribusi pada pemahaman sistematika yang lebih akurat dan memberi dasar ilmiah bagi pengembangan strategi konservasi spesies endemik yang adaptif terhadap ekologis lokal. Penelitian selanjutnya disarankan untuk mencakup penambahan lokasi sampling dan koloni dari wilayah-wilayah lain seperti Kalimantan, Bali, Lombok, dan Maluku serta mengintegrasikan pendekatan analisis whole genome untuk memperoleh resolusi genetik yang lebih tinggi pada A. dorsata asal Kepulauan Indonesia.

Asia possesses a complex geological and biogeographic history. The Asia evolution is shaped by tectonic plate movements, global climate change, and sea-level fluctuations. Indonesia situated at the convergence of three major tectonic plates (Eurasian, Indo-Australian, and Pacific) represents a key region in this dynamic context. Biogeographically, Indonesia is divided into three major zones: Sunda Shelf, Wallacea, and Sahul Shelf. The Wallacea region is particularly known for the high level of endemism caused by geographic isolation between the two shelves. One species that reflects this biogeographic complexity is the forest honey bee Apis dorsata, which is widely distributed across Asia. This species spans from the western (Sundaland) to the eastern region (Kei Islands) of Indonesia. Two of the three subspecies of A. dorsata are found in Indonesia: Apis dorsata dorsata and A. d. binghami. Apis d. dorsata is widely distributed except in Sulawesi and A. d. binghami is an endemic subspecies found only in Sulawesi and adjacent islands. These subspecies can be distinguished based on morphological and genetic characteristics. Molecular studies have revealed high genetic variation, particularly in geographically isolated populations. Although four lineages of A. dorsata have been identified, the genetic diversity within Indonesia, especially across the Sundaland, Lesser Sunda Islands, and Sulawesi, remains unrevealed. These regions are likely to harbor specific haplotypes crucial for conservation and evolutionary studies. Therefore, this study aimed to analyze the genetic variation of A. dorsata from the Indonesian Archipelago using mitochondrial DNA markers cytochrome c oxidase subunit 1 (COI), cytochrome c oxidase subunit 2 (COII), and non-coding region intergenic spacer (igs) COI/COII A total of 31 colonies of A. d. dorsata and two colonies of A. d. binghami collected from nine provinces across eight islands were included in this study. These samples are collections of Prof. Dr. Rika Raffiudin. DNA extraction using a modified Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) protocol. The DNA was amplified for COI and igs-regions and followed by sequencing. Sequences data were analyzed using BLAST-N, DnaSP 5.1, network versi 10.2.0.0, Genetyx Win versi 4.0, and MEGA X. The sequence length for COI, COII, and igs were 635 bp, 445 bp, and 24-25 bp, respectively. These sequences have been deposited in GenBank under the accession numbers COI (LC830603-LC830668) and igs-COII (LC845062-LC845127). In total, 33 variations of COI, 37 of COII, and one insertion-deletion mutation in igs were identified in the A. dorsata population across the Indonesian Archipelago. These variations resulted in 14 new COI haplotypes and 15 COII haplotypes, 13 of which are newly reported. The Sumatra1 haplotype emerged as the common haplotype of A. dorsata from Indonesia and is predominantly found in the Sundaland region, especially Sumatra. In contrast, the Wallacea (Lesser Sunda and Sulawesi) forest honey bee exhibited island-specific haplotypes with few shared haplotypes across regions. Endemic Sulawesi subspecies A. d. binghami v displayed one COI-specific haplotype and three COII-specific haplotypes characterized by high nucleotide variation. The only insertion-deletion variations in the igs region were also observed in this subspecies, offering a potential marker to distinguish A. d. dorsata and A. d. binghami. Nucleotide variation also caused amino acid alteration. One amino acid change was observed in the COI gene of A. dorsata from the Sumatra2 haplotype. In the COII gene, 24 amino acid mutations were identified, nine of which were exclusive to A. d. binghami. This study found two specific nucleotide variants in A. d. binghami that included amino acid changes, suggesting their potential as molecular markers for this subspecies. Apis dorsata from Sundaland exhibits a lower level of genetic diversity and differentiation compared to those from the Lesser Sunda and Sulawesi. This was reflected in nucleotide (?) and haplotype (Hd) diversity, especially in A. dorsata from Belitung and Java. Interestingly, honey bees from South Sumatra displayed the highest diversity, driven by the presence of a specific haplotype in each colony location. The fixation index (FST) value supported the low genetic differentiation among A. dorsata from Sundaland. The fixation index (FST) value showed Jambi and Belitung have genetic homogeneity (negative FST value). In contrast, forest honey bees from the Lesser Sunda and Sulawesi exhibited significantly higher levels of genetic differentiation. Median-Joining network (MJ network) and Maximum Likelihood (ML) phylogenetic analysis based on COI, COII, and concatenated COI-igs-COII sequences yield consistent results. These analyses delineated three major genetic groups of A. dorsata in Indonesia based on geographic distribution: (a) A. d. dorsata Sundaland (Sumatra, Belitung, Java, and Lombok); (b) A. d. dorsata Lesser Sunda (Sumbawa, Flores, Sermata-Southwest Moluccas); and (c) A. d. binghami Sulawesi. Apis d. binghami formed a basal lineage of A. dorsata from Indonesia indicating a more divergent evolutionary trajectory. The Sumatra1 haplotype was identified as the ancestral haplotype. The forest honey bees from the Lesser Sunda and Sulawesi also formed distinct clusters and were clearly separated from those of Sundaland. These findings support hypotheses of geographic isolation, evolutionary divergence, and potential speciation in Wallacea. This study successfully constructed a genetic database and demonstrated the utility of COI, COI, and igs of mitochondrial DNA markers in uncovering three major genetic groups and inferring the ancestral origin and distribution of A. dorsata from the Indonesian Archipelago. The findings contribute to a more accurate understanding the systematics of this species and provide a scientific foundation to developing conservation strategies for endemic species adapting to local ecological pressures. Future research is encouraged to expand the sampling scope, including additional colonies from another region, such as Kalimantan, Bali, Lombok, and the Moluccas, and to construct the whole genome of A. dorsata for higher resolution insight.