Karakterisasi Isolat Vibrio parahaemolyticus dan Evaluasi Potensi Vibriofag dalam Mengendalikan Penyakit AHPND pada Udang Vaname

Abstract

Vibrio parahaemolyticus merupakan patogen utama penyebab Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) pada udang yang menimbulkan kerugian signifikan bagi industri akuakultur. Upaya pengendalian yang ramah lingkungan menjadi sangat penting untuk mengurangi ketergantungan terhadap antibiotik. Salah satu alternatif yang menjanjikan adalah penggunaan vibriofag sebagai agen biokontrol spesifik. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi V. parahaemolyticus penyebab AHPND dari organ udang dan lingkungan tambak, mengisolasi dan mengarakterisasi vibriofag, serta mengevaluasi efektivitasnya dalam mematikan atau menghambat pertumbuhan V. parahaemolyticus secara in vitro. Isolasi bakteri dilakukan dari hepatopankreas, lambung, dan usus udang, serta sedimen dan air tambak menggunakan media selektif, diikuti uji fenotipik (biokimia dan fisiologis) dan genotipik untuk mendeteksi gen pirB. Vibriofag diisolasi menggunakan metode spot assay dan plaque assay, dan dikarakterisasi morfologinya menggunakan Transmission Electron Microscopy (TEM). Spesifisitas fag dianalisis melalui uji kisaran inang dan virulensinya diuji melalui Efficiency of Plating (EOP). Efektivitas fag dievaluasi menggunakan teknik microplate assay pada berbagai rasio Multiplicity of Infection (MOI). Sebagian besar isolat V. parahaemolyticus dari organ udang membawa gen pirB, menegaskan saluran pencernaan sebagai jalur infeksi utama. Hasil sekuensing menunjukkan V. parahaemolyticus BHP3N penyebab AHPND berpotensi sebagai mutan. Enam isolat vibriofag berhasil diperoleh dari berbagai sumber, dengan tiga diantaranya (FVPpD68, Gp, dan Ip) bersifat virulen dan dominan ditemukan pada sedimen dan air tambak. Ketiga vibriofag ini memiliki titer tinggi (107–1010 PFU/mL) dan menunjukkan spesifisitas serta virulensi tinggi terhadap V. parahaemolyticus AHPND berdasarkan hasil kisaran inang dan EOP. Hasil TEM menunjukkan perbedaan morfologi antar vibriofag, yang berpotensi memengaruhi mekanisme infeksi. Uji efektivitas in vitro menunjukkan bahwa FVPpD68 (MOI 0,0001), Gp (MOI 0,1), dan Ip (MOI 0,1) mampu melisiskan bakteri secara signifikan dalam waktu 20 jam, dengan aktivitas litik masing-masing sebesar 61,07%, 60,12%, dan 65,73%. Temuan baru dari studi ini mencakup isolasi vibriofag dari hepatopankreas udang, serta dari sedimen dan air tambak yang berasal dari kolam dengan kasus AHPND, terhadap V. parahaemolyticus yang berpotensi mutan. Selain itu, penelitian ini juga memperkenalkan pendekatan evaluasi efektivitas fag menggunakan variasi MOI yang dikombinasikan dengan teknik microplate assay. Pendekatan ini belum banyak dilaporkan dalam konteks pengujian fag terhadap V. parahaemolyticus penyebab AHPND di Indonesia. Secara keseluruhan, penelitian ini membuka peluang besar untuk pengembangan vibriofag sebagai alternatif yang efektif dan ramah lingkungan dalam mengendalikan AHPND pada budidaya udang, serta mendukung pengurangan penggunaan antibiotik dan penerapan akuakultur berkelanjutan.

Vibrio parahaemolyticus is the primary pathogen causing Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in shrimp, which leads to significant losses in the aquaculture industry. Environmentally friendly control measures are crucial to reduce reliance on antibiotics. One promising alternative is the use of vibriophages as specific biocontrol agents. This study aims to identify V. parahaemolyticus causing AHPND from shrimp organs and pond environments, to isolate and characterize vibriophages, and to evaluate their effectiveness in killing or inhibiting the growth of V. parahaemolyticus in vitro. Bacterial isolation was conducted from shrimp hepatopancreas, stomach, and intestines, as well as pond sediment and water using selective media, followed by phenotypic (biochemical and physiological) and genotypic tests to detect the pirB gene. Vibriophages were isolated using spot assay and plaque assay methods, and their morphology was characterized using Transmission Electron Microscopy (TEM). Phage specificity was analyzed through host range tests, and virulence was assessed via Efficiency of Plating (EOP). Phage effectiveness was evaluated using a microplate assay technique at various Multiplicity of Infection (MOI) ratios. Most V. parahaemolyticus isolates from shrimp organs carried the pirB gene, confirming the digestive tract as the main infection route. Sequencing results showed that the V. parahaemolyticus BHP3N strain causing AHPND has potential mutations. Six vibriophage isolates were successfully obtained from various sources, with three of them (FVPpD68, Gp, and Ip) being virulent and predominantly found in sediment and pond water. These three vibriophages had high titers (107–1010 PFU/mL) and demonstrated high specificity and virulence against AHPND-causing V. parahaemolyticus, based on host range and EOP results. TEM analysis revealed morphological differences among the vibriophages, potentially influencing their infection mechanisms. In vitro efficacy tests showed that FVPpD68 (MOI 0.0001), Gp (MOI 0.1), and Ip (MOI 0.1) significantly lysed bacteria within 20 hours, with lytic activities of 61.07%, 60.12%, and 65.73%, respectively. New findings from this study include the isolation of vibriophages from shrimp hepatopancreas, sediment, and pond water collected from ponds with AHPND cases targeting potentially mutant V. parahaemolyticus. Additionally, this study introduces an evaluation approach of phage efficacy using varying MOI combined with microplate assay techniques, which has been rarely reported in the context of testing phages against AHPND-causing V. parahaemolyticus in Indonesia. Overall, this research opens significant opportunities for developing vibriophages as an effective and environmentally friendly alternative to control AHPND in shrimp aquaculture, supporting reduced antibiotic use and promoting sustainable aquaculture practices.