Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Siderofor Hasil Isolasi dari Akar Nanas Simadu Subang

Abstract

Siderofor merupakan senyawa organik yang dapat disintesis oleh bakteri gram negatif maupun gram positif. Siderofor bertindak sebagai ligan pengikat besi untuk pelarutan dan pengangkutan besi di dalam sel. Kemampuan pengikatan yang kuat dari siderofor menawarkan manfaat signifikan di berbagai bidang penelitian dan aplikasi. Bakteri penghasil siderofor, isolat M7 yang diisolasi dari akar nanas varietas Simadu di Subang, Jawa Barat, Indonesia, telah diteliti. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis Biosynthesis Gene Clusters (BGCs) terkait biosintesis siderofor dari sekuen genom total isolat M7 dan menganalisis karakteristik siderofor yang dihasilkan. Sekuen genom total isolat M7 diperoleh melalui teknik Whole Genome Sequencing (WGS) menggunakan Oxford Nanopore Technology GridION dengan assembly dan annotation genom meliputi quality control menggunakan Quast, de novo assembly dengan Flye, polishing dengan MEDAKA, serta annotation gen menggunakan beberapa webserver. Selain itu, analisis kedekatan isolat M7 dengan spesies lain berdasarkan pada Analysis Nucleotide Identity (ANI). Identifikasi kemampuan hemolitik isolat M7 dilakukan dengan uji hemolisis isolat M7 menggunakan blood agar, serta prediksi sifat patogenitas dan keberadaan gen-gen virulensi menggunakan webserver PathogenFinder dan VirulenceFinder. Identifikasi BGCs yang terkait siderofor pada isolat ini dilakukan melalui genome mining menggunakan antiSMASH versi bakteri. Selain itu, identifikasi siderofor yang dihasilkan menggunakan Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). Analisis genom mengungkapkan bahwa isolat M7 memiliki nilai Guanine-Cytocine (GC) yang serupa dengan strain Providencia manganoxydans LLDRA6, dengan panjang urutan yang lebih panjang yaitu 4.447.159 bp. Anotasi genom menggunakan Rapid Annotation Subsystem Technology (RAST), mengungkapkan bahwa terdapat 3 dari 12 gen akumulasi siderofor, dan semua gen tersebut adalah untuk akumulasi aerobactin yang termasuk dalam sistem akusisi dan metabolisme besi pada isolat M7. Selain itu, perbandingan genom menggunakan perhitungan ANI, menunjukkan bahwa spesies P. manganoxydans merupakan spesies terdekat dengan isolat M7 dengan nilai ANI sebesar 98,82%. P. manganoxydans ini merupakan spesies yang erat kaitannya dengan kemampuan pengikatan logam-logam berat dalam bioremediasi lingkungan. Isolat M7 mengandung BGCs yang bertanggung jawab terhadap biosintesis siderofor melalui jalur Non-Ribosomal Peptide Synthase Independent Siderophore (NIS). Meskipun genom isolat M7 menunjukkan kesamaan tertinggi dengan spesies P. manganoxydans, BGCs yang terkait siderofor pada isolat ini memiliki kesamaan tertinggi dengan Providencia stuartii. Kesamaan gen yang bertanggung jawab dengan biosinesis siderofor antara isolat M7 dengan P. stuartii lebih dari 99%. Akan tetapi, perbedaan penting antara isolat M7 dan P. stuartii adalah bahwa P. stuartii bersifat patogen dan dapat menyebabkan penyakit pada manusia, sedangkan isolat M7 tidak menunjukkan sifat patogenik terhadap manusia. Analisis BGCs pada isolat M7 mengungkapkan adanya daerah yang mengandung dua gen utama yang bertanggung jawab untuk biosintesis siderofor. Gen-gen ini memiliki urutan nukleotida yang berbeda, tetapi mengkodekan protein yang sama yakni IucA/IucC family of siderophore biosynthesis protein yang bertanggung jawab untuk biosintesis aerobactin. Duplikasi gen-gen ini merupakan redundansi genetik yang memungkinkan mengekspresikan proteinnya secara bersamaan. Hal ini berpotensi meningkatkan akumulasi siderofor pada isolat M7 dibandingkan dengan strain P. manganoxydans dan P. stuartii yang hanya memiliki satu gen utama yang bertanggung jawab dalam biosintesis siderofor. Identifikasi siderofor yang dihasilkan oleh isolat M7 menggunakan LC-MS/MS mendeteksi adanya senyawa N6-acetyl-N6-hydroxy-L-lysine (ahLys) dan N2-citryl-N6-acetyl-N6-hydroxy-L-lysine (citryl-ahLys) sebagai senyawa prekursor yang penting bagi biosintesis aerobactin. Temuan ini berpotensi memiliki dampak yang signifikan pada aplikasi yang membutuhkan sistem akusisi besi yang efisien.

Siderophores are organic compounds synthesized by both Gram-negative and Gram-positive bacteria. They act as iron-chelating ligands, facilitating the solubilization and transport of iron into the cell. The strong iron-binding capabilities of siderophores offer significant benefits across various fields of research and application. A siderophore-producing bacteria, M7 isolate, was studied after being isolated from Simadu pineapple roots in West Java, Indonesia. This study aimed to analyze the siderophore Biosynthesis Gene Cluster (BGC) from the total genome sequence of M7 isolate and characterize the produced siderophores. The total genome sequence of isolate M7 was obtained through Whole Genome Sequencing (WGS) using Oxford Nanopore Technology GridION. Genome assembly and annotation included quality control using Quast, de novo assembly with Flye, polishing with MEDAKA, and gene annotation using various web servers. Additionally, the similarity of the M7 isolate to other species was analyzed using Average Nucleotide Identity (ANI). The hemolytic capability of the M7 isolate was identified through hemolysis testing on blood agar, while its pathogenicity potential and the presence of virulence genes were predicted using the PathogenFinder and VirulenceFinder web servers. BGCs related to siderophore production in this isolate were identified through genome mining using antiSMASH bacterial version. The characteristics of the siderophores produced were identified using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). Genomic analysis revealed that the M7 isolate has a Guanine-Cytosine (GC) content similar to that of Providencia manganoxydans LLDRA6, with a longer sequence length of 4,447,159 bp. Genome annotation using Rapid Annotation Subsystem Technology (RAST) revealed the presence of an aerobactin siderophore gene within the iron acquisition and metabolism system of the M7 isolate. Furthermore, genome comparison using ANI calculations showed that P. manganoxydans is the closest species to the M7 isolate, with an ANI value of 98.82%. P. manganoxydans is closely associated with the ability to bind heavy metals in environmental bioremediation. The M7 isolate contains BGCs responsible for siderophore biosynthesis through the Non-Ribosomal Peptide Synthase Independent Siderophore (NIS) pathway. Although the genome of isolate M7 shows the highest similarity to P. manganoxydans, the siderophore-related biosynthesis gene clusters (BGCs) in this isolate are most like those in Providencia stuartii. The gene similarity responsible for siderophore biosynthesis between isolate M7 and P. stuartii exceeds 99%. However, a significant difference is that P. stuartii is pathogenic and can cause diseases in humans, whereas isolate M7 does not exhibit pathogenic properties toward humans. BGC analysis in the M7 isolate revealed a region containing two core genes responsible for siderophore biosynthesis. These genes have different nucleotide sequences but encode the same protein family, namely the IucA/IucC family of siderophore biosynthesis proteins, which are responsible for aerobactin biosynthesis. The duplication of these genes represents genetic redundancy that enables simultaneous protein expression. This redundancy may potentially increase siderophore accumulation in the M7 isolate compared to strains P. manganoxydans and P. stuartii, which only possess a single core gene responsible for siderophore biosynthesis. Identification of siderophores produced by the M7 isolate using LC-MS/MS detected the presence of N6-acetyl-N6-hydroxy-L-lysine (ahLys) and N2-citryl-N6-acetyl-N6-hydroxy-L-lysine (citryl-ahLys), which are crucial precursor for aerobactin biosynthesis. These findings could have significant implications for applications requiring an efficient iron acquisition system.