Konstruksi Vektor CRISPR/Cas9 untuk Pengeditan Gen ROC5 pada Padi Kultivar Hawara Bunar

Abstract

Peningkatan produksi padi (Oryza sativa L.) dengan mengoptimalkan pemanfaatan lahan kering masam memerlukan upaya pemuliaan untuk meningkatkan efektifitas toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan. Padi kultivar Hawara Bunar merupakan varietas toleran asam yang perlu ditingkatkan kemampuan toleransinya terhadap cekaman kekeringan dengan mengatur tingkat penggulungan daun. Gen ROC5 adalah gen yang terlibat dalam penggulungan daun. Pengeditan gen ROC5 dengan teknologi CRISPR/Cas9 diharapkan dapat menghasilkan tanaman mutan yang lebih toleran kekeringan dengan respon penggulungan daun yang moderat dalam kondisi cekaman kekeringan. Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi vektor rekombinan yang membawa sgRNA untuk gen ROC5 dari tanaman padi kultivar Hawara Bunar. Plasmid pRGEB32 yang mengandung gen Cas9 digunakan untuk mengklon sgRNA ROC5 dengan metode kloning Golden Gate dan transformasi heat shock. Konfirmasi sgRNA-ROC5 dilakukan dengan PCR koloni, lalu plasmid diisolasi dan dilanjutkan verifikasi menggunakan metode PCR dengan primer spesifik dan primer sekuensing untuk vektor pRGEB32. Hasilnya menunjukkan bahwa hanya bakteri transforman pRGEB32_ROC5-cr1 yang tumbuh pada media seleksi. Hal ini mengindikasikan bahwa sgRNA ROC5 berhasil disisipkan pada plasmid. Konfirmasi dengan PCR koloni dan PCR plasmid menggunakan primer spesifik membuktikan terdapat amplikon berukuran 425 bp. Data sekuensing juga menunjukkan terdapat sekuen sgRNA ROC5 pada lokasi yang sesuai.