Identifikasi dan Karakterisasi Molekuler Gen-Gen Pengontrol Pembungaan pada Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.)

Abstract

Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) adalah tanaman penghasil minyak nabati utama yang dapat digunakan sebagai bahan pangan maupun bahan bakar. Produktivitas perkebunan kelapa sawit Indonesia masih rendah dengan hanya 3,9 ton/hektar/tahun dibandingkan dengan potensi hasil yang dapat mencapai 7,4 ton/hektar/tahun, sehingga perlu adanya percepatan program pemuliaan. Fase vegetatif yang memakan waktu sekitar tiga sampai empat tahun menyebabkan proses pemuliaan kelapa sawit berjalan sangat lambat. Teknologi FasTrack breeding, yang memanfaatkan gen-gen pengontrol pembungaan, menawarkan solusi potensial untuk mempercepat pembungaan. Akan tetapi, informasi tentang gen-gen tersebut pada kelapa sawit sangat terbatas, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi gen pengontrol pembungaan pada kelapa sawit. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan informasi tentang jalur metabolisme hulu dalam induksi pembungaan kelapa sawit. Pemahaman atas mekanisme dan gen-gen yang terlibat dalam pembungaan dapat memfasilitasi pembentukan galur-galur kelapa sawit yang berbunga lebih cepat melalui rekayasa genetika, sehingga dapat diaplikasikan dalam proses percepatan pemuliaan kelapa sawit. Tahapan penelitian meliputi: (1) Studi in silico kandidat gen-gen pengontrol pembungaan dengan menggunakan pemodelan protein; (2) Kloning, transformasi, dan karakterisasi kandidat gen terpilih ke dalam tanaman model (Arabidopsis thaliana) serta evaluasi genotipe dan fenotipe tanaman hasil transformasi. (3) Evaluasi ekspresi kandidat gen pembungaan kelapa sawit di daun dan organ reproduksi. (4) Karakterisasi promotor gen pembungaan. Protein homolog Flowering Locus T (FT) / Heading date 3a (Hd3a) dari kelapa sawit berhasil diidentifikasi melalui pemodelan protein berdasarkan struktur protein FT dari A. thaliana dan padi. Dengan memanfaatkan model protein dan informasi mengenai residu asam amino penting, fungsi dari protein homolog dapat diprediksi. Analisis BLASTp pada basis data NCBI berhasil mengidentifikasi delapan belas kandidat protein dari keluarga phosphatidylethanolamine-binding protein (PEBP). Tiga belas protein menunjukkan tingkat homologi sekuen yang tinggi dan cakupan kueri yang luas terhadap sekuen AtFT/OsHd3a. Analisis filogenetik berhasil mengelompokkan protein-protein tersebut menjadi tiga sub-famili: FT, Terminal Flower 1 (TFL1), dan Mother of FT and TFL1 (MFT). Kesamaan struktural ditemukan di antara protein kelompok FT, namun variasi residu asam amino di lokasi penting mengubah aktivitasnya. Tiga protein diidentifikasi sebagai florigen potensial: EgHd3a-1, EgHd3a-2, dan EgHd3a-3. Dua dari tiga gen, EgHd3a-1 and EgHd3a-2, yang diidentifikasi berhasil dikloning ke vektor ekspresi pCAMBIA 1300. Gen EgHd3a-3 tidak dapat terdeteksi pada seluruh jaringan yang diperiksa sehingga tidak dapat diinvestigasi lebih lanjut. Gen EgHd3a-1 dan EgHd3a-2 berhasil ditransformasikan ke A. thaliana melalui metode floral drip. Hasil dari overekspresi tersebut menunjukkan bahwa A. thaliana transgenik berbunga lebih cepat dibandingkan A. thaliana tipe liar, sehingga EgHd3a-1 dan EgHd3a-2 terindikasi berperan sebagai florigen dengan mempercepat proses pembungaan. Tingkat ekspresi gen EgHd3a-1 dan EgHd3a-2 berhasil diukur menggunakan quatitative PCR (qPCR). Primer yang dirancang dengan mempertimbangkan batas ekson-intron-ekson terbukti spesifik dan tervalidasi. Hasil qPCR menunjukkan bahwa gen EgHd3a-1 terekspresi tinggi pada bunga, terutama pada bunga jantan matang, tetapi rendah pada bunga betina, daun, dan pelepah. Gen EgHd3a-2 menunjukkan ekspresi tinggi pada bunga betina muda, tetapi sangat rendah pada bunga jantan, daun, dan pelepah. Tidak ada perbedaan pola signifikan dalam ekspresi penyambungan alternatif (alternative splicing) pada kedua gen ini di antara sampel yang diuji. Promotor gen EgHd3a-1 dan EgHd3a-2 telah berhasil dikloning, disambungkan ke gen ß-glucuronidase (GUS), dan ditransformasikan ke tanaman A. thaliana. Uji histokimia GUS berhasil merinci aktivitas promotor pada semua organ dan tahap siklus hidup. Aktivitas pEgHd3a-1 teramati di jaringan pembuluh pada daun selama fase reproduktif, buah, akar, dan terutama pada stamen. Sementara itu, pEgHd3a-2 teraktivasi di seluruh jaringan kecambah, jaringan meristem apikal pada tanaman dewasa, dan sedikit terekspresi pada kelopak bunga. Temuan dari studi promotor ini konsisten dengan hasil uji ekspresi gen pada tanaman kelapa sawit. Studi ini memberikan gambaran komprehensif tentang mekanisme induksi pembungaan pada kelapa sawit. Induksi pembungaan diduga melibatkan aktivitas gen EgHd3a-1 pada jaringan pembuluh di daun selama fase reproduktif. Hal ini menunjukkan perannya yang penting dalam proses pembentukan bunga. Induksi pembungaan diduga terjadi karena adanya akumulasi protein EgHd3a yang ditranslokasi dari daun ke meristem apikal, bersama dengan protein EgHd3a-2 yang konsisten dihasilkan di jaringan yang sama. Model ini menjelaskan kelapa sawit dapat berbunga sepanjang tahun, dengan ekspresi konstitutif EgHd3a-2 yang diduga berfungsi menstabilkan kondisi floral meristem. Ekspresi EgHd3a-1 yang tinggi pada stamen menunjukkan hubungan yang kuat dengan perkembangan bunga jantan. Fakta ini menyoroti peran penting EgHd3a-1 dalam pengembangan stamen di kelapa sawit. Hasilnya menunjukkan adanya hubungan potensial antara ekspresi EgHd3a-1 pada bunga jantan dan respons stres, meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memahami mekanisme yang mendasarinya. Proses ini mungkin melibatkan jalur sinyal molekuler yang dipicu oleh faktor lingkungan. Temuan ini membuka peluang besar untuk mengembangkan teknologi pemuliaan kelapa sawit yang lebih efisien dan cepat. Dengan teknologi FasTrack breeding, yang memanfaatkan gen-gen pembungaan untuk mempercepat fase generatif tanaman, proses pemuliaan kelapa sawit diperkirakan dapat dipersingkat dari 15-20 tahun menjadi hanya 3-4 tahun. Meski memerlukan investasi besar untuk membangun infrastruktur riset, return of investment dapat diperoleh melalui penghematan biaya pemuliaan yang dapat dinikmati dalam jangka panjang. Selain itu, pemenuhan kebutuhan bibit kelapa sawit unggul juga dapat dicapai dalam waktu yang lebih singkat.

Oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) is a prominent vegetable oil-producing plant that can be used for food and fuel. The productivity of Indonesian oil palm farms remains low at 3.9 tons/hectare/year, compared to potential yields of 7.4 tons/hectare/year, indicating the need to speed the breeding program. The vegetative phases require approximately three-four years, resulting in a prolonged oil palm breeding process. FasTrack breeding technology can help to accelerate the breeding process for annual plants. FasTrack breeding technology requires genes that can control flowering. More information regarding flowering regulatory genes in oil palms is needed; thus, more research is required. This study aims to identify potential genes that regulate flowering time in oil palms. The research is expected to provide insights into the upstream metabolic processes involved in the induction of oil palm flowering. Understanding these mechanisms and genes can facilitate the development of genetically engineered oil palm lines that flower faster, thereby accelerating breeding efforts. The research involves several stages: (1) In silico analysis of potential flowering regulatory genes using protein modelling; (2) Cloning, transforming, and characterizing selected candidate genes in model plants (Arabidopsis thaliana) and analyzing the genotype and phenotype of the transformed plants; (3) Evaluating the expression of putative oil palm flowering genes in leaves and reproductive organs; and (4) Analyzing the promoters of flowering genes. The study identified the Flowering Locus T (FT) / Heading date 3a (Hd3a) homologous protein in oil palm through modelling its structure based on the FT protein from A. thaliana and rice. Protein models and knowledge of crucial amino acid residues were used to predict the functions of homologous proteins. A BLASTp analysis of the NCBI database identified eighteen candidate proteins from the phosphatidylethanolamine-binding protein (PEBP) family. Thirteen proteins exhibited high sequence homology and extensive curation coverage of the AtFT/OsHd3a sequence. Phylogenetic analysis divided these proteins into three sub-families: FT, Terminal Flower 1 (TFL1), and Mother of FT and TFL1 (MFT). Structural similarities were noted among the FT group proteins, but variations in amino acid residues at crucial locations altered their activity. Three proteins were identified as potential florigens: EgHd3a-1, EgHd3a-2, and EgHd3a-3. Two of the identified genes, EgHd3a-1 and EgHd3a-2, were successfully cloned into the pCAMBIA 1300 expression vector. The EgHd3a-3 gene was not expressed in any tissues analyzed, precluding further study. EgHd3a-1 and EgHd3a-2 genes were successfully transformed into A. thaliana via the floral drip method. Overexpression of these genes in A. thaliana confirmed that EgHd3a-1 and EgHd3a-2 function as florigens, accelerating the flowering process. Quantitative PCR (qPCR) measured the expression levels of EgHd3a-1 and EgHd3a-2. Primers designed for exon-intron-exon boundaries were specific and validated. qPCR results showed that EgHd3a-1 was significantly expressed in flowers, especially mature male flowers, but low in female flowers, leaves, and fronds. EgHd3a-2 was highly expressed in immature female flowers but low in male flowers, leaves, and fronds. No significant changes in alternative splicing expression patterns were observed for these genes across the samples studied. The promoters of EgHd3a-1 and EgHd3a-2 were successfully cloned, linked to the ß-glucuronidase (GUS) gene, and introduced into A. thaliana. The GUS histochemical assay reported promoter activity across various organs and life cycle stages. pEgHd3a-1 was active in vascular tissue in leaves during the reproductive phase, fruit, roots, and stamens. pEgHd3a-2 showed activity in various sprout tissues and the apical meristem tissue of adult plants, with slight expression in flower petals. The findings are consistent with the results of gene expression study in oil palm. This study provides a comprehensive overview of the flowering induction mechanism in oil palms. The EgHd3a-1 gene, active in the vascular tissue of leaves during the reproductive phase. This indicates a crucial role in flower formation. The accumulation of EgHd3a protein, transported from leaves to the apical meristem, is believed to induce flowering. The EgHd3a-2 protein, consistently synthesized in the same meristem tissue, may contribute to the stability of the floral meristem, suggesting oil palms can flower continuously throughout the year. The high expression of EgHd3a-1 in stamens indicates its strong association with male flower development. This highlights EgHd3a-1's crucial role in developing male reproductive organs in oil palm. The results suggest a potential link between EgHd3a-1 expression in male flowers and stress response, although further research is needed to understand the underlying mechanisms. This process may involve molecular signaling pathways triggered by environmental factors. These findings offer significant prospects for developing more efficient and faster oil palm breeding technology. Utilizing FasTrack breeding technology, which utilizes early flowering genes to fasten plant generative phase, the oil palm breeding process could be reduced from fifteen to twenty-five years to three to four years. Building research infrastructure requires significant investment, but long-term savings on breeding costs can yield a significant return on investment. Furthermore, the demands of superior oil palm seedlings can be met faster.