Karakterisasi morfologi, analisis ploidi dan kultur antera anggrek Phalaenopsis in vitro

Abstract

Anggrek bulan (Phalaenopsis) merupakan salah satu genus penting dalam famili Orchidaceae yang bernilai ekonomi tinggi dan memiliki pasar yang besar di dalam maupun luar negeri. Varietas Phalaenopsis hibrida belum banyak diproduksi dalam negeri, sehingga untuk penyediaan bibit anggrek, pengusaha Indonesia masih tergantung pada varietas impor dari Taiwan dan Thailand. Indonesia perlu mandiri dalam memproduksi varietas hibrida sendiri, oleh karena itu, pemuliaan hibrida tanaman anggrek memerlukan galur murni sebagai tetua persilangan dalam merakit varietas hibrida. Galur murni dalam bentuk tanaman dihaploid (doubled haploid/ DH) dapat dihasilkan melalui kultur antera. Perakitan galur murni melalui perbanyakan konvensional umumnya dilakukan dengan penyerbukan sendiri sampai beberapa generasi yang membutuhkan waktu yang lama. Selain itu, penyerbukan terkadang gagal karena kuncup bunga yang belum menghasilkan (the abortion of immature pod) atau polong yang kosong (tanpa biji). Maka dari itu, teknologi androgenesis dapat diadopsi dalam pemuliaan tanaman hibrida. Informasi tingkat ploidi dari tanaman induk perlu diketahui sebelum dilakukan kultur antera. Tingkat ploidi tanaman donor berpengaruh terhadap respons tumbuh dan regenerasi tanaman dari kultur antera. Karakterisasi morfologi juga penting diamati karena berfungsi sebagai kelengkapan informasi sebelum genotipe tertentu dimanfaatkan untuk kegiatan pemuliaan tanaman. Tujuan umum penelitian ini adalah upaya memperoleh informasi awal dan protokol terbaik dalam merakit tetua galur murni Phalaenopsis hibrida secara in vitro. Sejauh ini belum ada protokol yang mampu menginduksi tanaman dihaploid anggrek, para peneliti masih melakukan penelitian lebih lanjut, oleh karena itu penelitian ini penting dilakukan. Penelitian ini terdiri atas tiga percobaan. Percobaan pertama yaitu menganalisis keragaman morfologi dan tingkat ploidi menggunakan flow cytometry pada Phalaenopsis hibrida kompleks yaitu tiga kultivar hibrida standar (WAL 1702, WAL 1819, WAL 1981), tiga kultivar hibrida novelty multiflora (WAL 3903, WAL 3904 dan WAL 3908) dan tiga Phalaenopsis spesies (Phalaenopsis amabilis (PAB), Phalaenopsis amboinensis (PAM), Phalaenopsis schilleriana (PSC)). Analisis flow cytometry dari sel daun muda dan ujung akar. Zea mays diploid digunakan sebagai standar internal untuk menghitung kandungan DNA inti sampel. Hasil penelitian menunjukkan adanya perbedaan karakter morfologi yang signifikan antara enam kultivar hibrida Phalaenopsis. Kultivar WAL 1819 memiliki ukuran tanaman dan bunga paling besar sedangkan kultivar WAL 3903 memiliki jumlah bunga terbanyak. Analisis flow cytometry menunjukkan Phalaenopsis kultivar dan spesies yang dianalisis mengalami kondisi endopoliploidi dengan pola ploidi 2C–16C. Kultivar hibrida standar yang berukuran lebih besar cenderung memiliki kandungan DNA lebih kecil (5,7– 11,4 pg) dibandingkan kultivar novelty multiflora (9,4 – 15,4 pg). Percobaan kedua bertujuan untuk mempelajari pengaruh stadia perkembangan bunga dan media kultur + kombinasi Zat Pengatur Tumbuh (ZPT). Stadia perkembangan bunga diambil dari beberapa kultivar dan diberi pra-perlakuan suhu dingin selama 24 dan 48 jam, kemudian kultivar dan waktu pendinginan dilakukan analisis uji T. Penelitian menggunakan kultivar hibrida kompleks (WAL 1702, WAL 3903 dan WAL 3904). Sebelum dikulturkan, antera diberi pra-perlakuan waktu suhu dingin 4°C selama 24 jam dan 48 jam. Penelitian ini terdapat dua faktor yaitu stadia perkembangan bunga (mekar, ½ mekar dan kuncup) dan media kultur (MD1, MD2, ND1, ND2). Hasil penelitian menunjukkan bahwa antera dapat membentuk kalus embriogenik. Stadia bunga mekar merupakan stadia bunga terbaik dalam menghasilkan kalus dari antera. Media kultur tidak berpengaruh nyata terhadap semua peubah yang diamati kecuali persentase antera pecah pada stadia perkembangan bunga kultivar WAL 3903 (24 jam), antera yang dikulturkan di dalam media konsentrasi ND2 (N6 + 2 ppm 2,4-D + 1 ppm TDZ) menghasilkan persentase antera pecah terbaik sebesar 55,5%. Dari semua kultivar yang digunakan, kultivar WAL 1702 menunjukkan respons terbaik dalam semua peubah. Waktu pendinginan terbaik dalam induksi kalus adalah 24 jam. Pada penelitian ini hanya sampai tahap kalus embriogenik dan belum ada kalus yang berhasil meregenerasi menjadi planlet. Pada subkultur dalam media induksi kalus kedua terdapat penambahan antera berkalus sebanyak 11 antera. Percobaan ketiga bertujuan untuk mempelajari pengaruh AgNO3 dan putresin dalam suatu media terhadap kultur antera tanaman anggrek Phalaenopsis. Tanaman donor menggunakan kultivar hibrida kompleks WAL 2902. Faktor penelitian ada dua yaitu AgNO3 (0; 15 dan 30 ppm) dan putresin (0; 0,3; dan 1 mM). Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase antera membengkak tertinggi terdapat perlakuan konsentrasi 0 ppm AgNO3 + 0,3 mM putresin dan konsentrasi 15 ppm AgNO3 + 1 mM putresin. Persentase antera pecah tertinggi terdapat pada perlakuan konsentrasi 0 ppm AgNO3 + 0 mM putresin. Persentase antera berkalus akibat pemberian konsentrasi AgNO3 berkisar antara 20,2 – 21,9%, sedangkan putresin memiliki nilai rata-rata persentase antera berkalus berkisar antara 15,8 - 25,4% pada umur 4 Minggu Setelah Inisiasi (MSI). Setiap subkultur ke media baru tiap 4 minggu sekali, antera mengalami penambahan jumlah antera berkalus. Selain itu, perlakuan konsentrasi AgNO3 dan putresin merupakan kombinasi yang cocok untuk mengatasi senesens akibat vitrifikasi/hyperhydricity berdasarkan peubah persentase perubahan warna menuju senesens. Pada 12 MSI, perlakuan kontrol memiliki persentase warna putih tertinggi yaitu 21,1%. Belum ada antera yang membentuk kalus hijau ataupun beregenerasi menjadi tanaman pada semua perlakuan yang diuji.

The Moon Orchid (Phalaenopsis) is an important genus in the Orchidaceae family, with high economic value and a large market both domestic and international. Hybrid Phalaenopsis varieties are not yet widely produced domestically, so for the supply of orchid seedlings, Indonesian entrepreneurs still depend on imported varieties from Taiwan and Thailand. Achieving self-sufficiency in producing hybrid varieties is crucial, and the hybrid plant breeding process requires pure lines as parental crosses to breed hybrid varieties. Pure lines in the form of doubled haploid (DH) plants can be obtained through anther culture. Traditional development of pure lines through conventional breeding is time-consuming, involving self-pollination for several generations, and is prone to failures such as the abortion of immature or empty pods. Therefore, androgenesis technology can be adopted in the breeding of hybrid plants. Knowledge of the ploidy level of parent plants is necessary to support anther culture. The ploidy level of the donor plant affects the growth response and regeneration of plants from anther culture. Morphological characterization is also essential as it provides additional information before specific genotypes are utilized in plant breeding activities. This research aimed to obtain preliminary information and the best protocol for obtainment of pure lines of hybrid Phalaenopsis in vitro. Currently, there is no protocol capable of inducing doubled haploid orchid plants, and researchers are still conducting further studies. Hence, this research is crucial. The study consisted of three experiments. The first experiment analyzed morphological diversity and ploidy level using flow cytometry on a complex hybrid of Phalaenopsis, including three standard hybrid cultivars (WAL 1702, WAL 1819, WAL 1981), three novelty multiflora hybrid cultivars (WAL 3903, WAL 3904, and WAL 3908), and three Phalaenopsis species (Phalaenopsis amabilis, Phalaenopsis amboinensis, Phalaenopsis schilleriana). Flow cytometry analysis was conducted on young leaf cells and root tips, with Zea mays diploid was used as an internal standard to calculate the nuclear DNA content of the samples. Results showed significant morphological differences among the six Phalaenopsis hybrid cultivars. WAL 1819 had the largest plant and flower size, while WAL 3903 had the highest flower count. Flow cytometry analysis indicated endopolyploidy conditions with a ploidy pattern ranging from 2C to 16C. Standard hybrid cultivars with larger sizes tended to have smaller DNA content (5.7–11.4 pg) than novelty multiflora cultivars (9.4–15.4 pg). The second experiment aimed to study the effect of flower development stage and culture media + Plant Growth Regulator (PGR) combination. Flower development stages were taken from several cultivars and given cold temperature pre-treatment for 24 and 48 hours, then the cultivar and cooling time were analyzed using T-test. The research used complex hybrid cultivars (WAL 1702, WAL 3903, and WAL 3904). Before culturing, the anthers were pre-treated at a cold temperature of 4°C for 24 hours and 48 hours. This research had two factors: flower development stages (bloom, half bloom, and bud) and culture media (MD1, MD2, ND1, ND2). Research results indicate that anthers can form embryogenic callus. The blooming flower stage is the best stage for producing callus from anthers. The culture media did not have a significant effect on all the variables observed except the percentage of broken anthers at the flower development stage of the WAL 3903 cultivar (24 hours). Anthers cultured in media with a concentration of ND2 (N6 + 2 ppm 2.4-D + 1 ppm TDZ) produced the best percentage of broken anthers, which was 55.5%. Of all the cultivars used, The WAL 1702 cultivar showed the best response in all variables. The best cooling time for callus induction was 24 hours. In this study, it only reached the embryogenic callus stage and no callus had succeeded in regenerating into plantlets. In the subculture, in the second callus induction medium, there was an addition of callus anthers of 11 anthers. The third experiment aimed to study the effect of AgNO3 and putrescine in a medium on the anther culture of Phalaenopsis orchids. The donor plant used the complex hybrid cultivar WAL 2902. There were two research factors, namely AgNO3 (0; 15, and 30 ppm) and putrescine (0; 0.3; and 1 mM). The results showed that the highest percentage of swollen anthers occurred in treatments with a concentration of 0 ppm AgNO3 + 0.3 mM putrescine and a concentration of 15 ppm AgNO3 + 1 mM putrescine. The highest percentage of ruptured anthers was found in the treatment with a concentration of 0 ppm AgNO3 + 0 mM putrescine. The percentage of anthers with callus due to the application of AgNO3 concentrations ranged between 20.2% to 21.9%, while putrescine exhibited an average percentage value of anthers with callus ranging from 15.8% to 25.4% at the age of 4 Week After Initiation (WAI). In each subculture to new media every 4 weeks, the number of anthers forming callus. In addition, AgNO3 and putrescine concentration treatment was a suitable combination to overcome senescence due to vitrification/ hyperhydricity based on the percentage change in color towards senescence. At 12 MSI, the control treatment had the highest percentage of white color, namely 21.1%. None of the anthers formed callus or regenerated into plants in any of the treatments tested.