Karakterisasi In Silico dan In Vitro serta Optimasi Produksi Enzim Fitase Aspergillus niger IPB CC 93 0265

Abstract

Asam fitat merupakan senyawa kimia yang terdiri dari inositol dan asam fosfat dan merupakan senyawa antinutrien yang terdapat pada bahan pakan unggas monogastrik yang terbuat dari tanaman serealia. Fitase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis ikatan fosfoester pada asam fitat sehingga menghasilkan fosfat anorganik dan ester fosfat. Aspergillus merupakan salah satu genus kapang yang dapat menghasilkan fitase dan telah banyak digunakan dalam produksi fitase karena mudah dibudidayakan. A. niger, A. awamori dan A. ficuum merupakan tiga spesies Aspergillus yang menghasilkan fitase dengan struktur dan sifat fisikokimia yang paling sesuai untuk diaplikasikan pada pakan unggas serta memiliki tingkat homologi yang cukup tinggi. Penelitian terdahulu telah membuktikan bahwa kapang A. niger, A. ficuum dan A. awamori merupakan tiga spesies Aspergillus yang menghasilkan fitase dengan karakteristik fisikokimia serta struktur yang homolog dan cocok untuk diaplikasikan pada pakan secara in silico. Namun, belum dilakukan penelitian mengenai perbandingan penambatan molekuler enzim fitase dari ketiga kapang untuk menentukan spesies Aspergillus yang paling cocok. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan simulasi penambatan molekuler pada enzim fitase dari tiga spesies Aspergillus dengan kemiripan tertinggi serta mengoptimalkan kondisi produksi dan karakterisasi sederhana enzim fitase dari spesies Aspergillus yang mempunyai karakteristik terbaik hasil dari molekuler docking sebagai langkah pertama dalam produksi enzim fitase skala besar untuk diterapkan pada pakan unggas. Metode yang digunakan adalah pemodelan struktur dan penambatan molekuler in silico yang dikombinasikan dengan optimasi kondisi produksi secara in vitro meliputi pH, waktu inkubasi dan konsentrasi penginduksi fitase A. niger IPB CC 93 0265. Hasil docking ketiga struktur fitase menggunakan YASARA menunjukkan bahwa fitase 1QFX memiliki skor ΔG paling negatif dan skor Kd terkecil yang menunjukkan afinitas tertinggi terhadap substrat asam fitat. Fitase A. niger IPB CC 93 0265 mempunyai aktivitas spesifik tertinggi setelah produksi 4 hari dengan medium pH 7 dan induser fitat 0,5%. Kemurnian tertinggi diraih dari fraksi dialisis dengan aktivitas spesifik sebesar 0.18 U/µg, persentase yield sebesar 49.61% dan kemurnian meningkat sebesar 4.01 kali lipat dibandingkan ekstrak kasar. Nilai Km terukur 6.583 µmol serta vmaks sebesar 0.139 µmol/menit. Fitase A. niger IPB CC 93 0265 memiliki bobot molekul di rentang 25 – 37 KDa. Kesimpulan dari penelitian ini adalah diantara 3 struktur fitase yang telah dibandingkan dan di-docking dengan asam fitat, fitase 1QFX dari A. niger merupakan fitase yang paling sesuai untuk diaplikasikan pada pakan unggas setelah 4 hari produksi enzim dalam medium pH 7 dan konsentrasi fitat 0,5%.

Phytic acid is a chemical compound consisting of inositol and phosphoric acid and is an antinutrient compound found in monogastric poultry feed ingredients made from cereal crops. Phytase is an enzyme that can hydrolyze phosphoester bonds in phytic acid, resulting in inorganic phosphate and phosphate esters. Aspergillus is a genus of mold that can produce phytase and has been widely used in the production of phytase because it is easily cultured. A. niger, A. awamori and A. ficuum are three Aspergillus species that produce phytase with the most suitable structure and physicochemical properties for application in poultry feed and have a fairly high level of homology. Previous research has proven that A. niger, A. ficuum and A. awamori are three Aspergillus species that produce phytases with in silico physicochemical characteristics and homologous structures which is suitable for application to feed. However, research has not been carried out regarding the comparison of the molecular docking of the phytase enzyme from these three molds to determine the most suitable Aspergillus species. The goals of this study were to carry out molecular docking simulations on phytase from three Aspergillus species with the highest similarity as well as optimize production conditions and conduct simple characterization of phytase enzymes from Aspergillus species which have the best characteristics based on molecular docking as the first step in large-scale phytase enzyme production for application in poultry feed. The method used was in silico structural modeling and molecular docking in combination with in vitro pH, incubation time and phytate inducer concentration optimization of A. niger IPB CC 93 0265 phytase. The docking results from the three phytase structures using YASARA showed that phytase 1QFX has the most negative ΔG score and the smallest Kd score, which indicated the highest affinity to a phytic acid substrate. Phytase from A. niger IPB CC 93 0265 has the highest specific activity after 4 days production with pH 7 medium and 0,5% phytate inducer. The highest purity was achieved from the dialysis fraction with a specific activity of 0.18 U/µg, a yield percentage of 49.61% and a purity increase of 4.01 times compared to the crude enzyme. The measured Km value was 6.583 µmol and vmaks was 0.139 µmol/minute. Phytase A. niger IPB CC 93 0265 has a molecular weight in the range of 25 – 37 KDa. The conclusion of this research is that among the 3 phytase structure that have been compared and docked with the phytic acid, phytase 1QFX from A. niger is the most suitable phytase to be applied to poultry feed after 4 days of enzyme production with pH 7 and 0,5% of phytate content medium.