Analisis In Silico dan Ekspresi Fragmen Faktor C dari Tachypleus gigas Pada Khamir Pichia pastoris

Abstract

Belangkas merupakan hewan laut yang sering dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan endotoksin bakteri gram negatif. Darah belangkas mengandung komponen protein faktor C yang berfungsi sebagai biosensor yang dapat mendeteksi keberadaan endotoksin/lipopolisakarida dari bakteri gram negatif. Pengujian endotoksin dari darah belangkas dibutuhkan dalam jumlah yang sangat banyak sehingga tidak efisien dalam penggunaan bahan percobaan hidup. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk efisiensi dari percobaan ini adalah dengan mensintesis gen fragmen faktor C yang terdapat dalam lisat/darah belangkas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui interaksi protein fragmen faktor C dengan substrat lipopolisakarida (lipid A) secara in silico, serta mensintesis gen fragmen faktor C secara heterologus pada khamir Pichia pastoris GS115. Penelitian ini terbagi menjadi dua tahapan yaitu analisis in silico meliputi kelarutan protein, pemodelan protein, penambatan molekuler dan Simulasi dinamika molekuler protein fragmen faktor C. Protein fragmen faktor C dimodelkan menggunakan tiga server web pemodelan yang memiliki struktur 3D diantaranya α-helix, β-sheet dan loop/coil. Validasi model protein dengan Ramachandran plot, ERRAT dan verify 3D. Tahapan kedua yaitu analisis in vitro yang dilakukan dengan konstruksi plasmid rekombinan, kloning plasmid rekombinan pada Escherichia coli DH5α, transformasi gen fragmen faktor C untuk diekspresikan pada sel inang P. pastoris GS115. Hasil analisis fisikokimia protein fragmen faktor C diprediksikan memiliki kelarutan yang tinggi dengan nilai titik Isoelektrik (pI) yaitu 6,57. Pemodelan AlphaFold menunjukkan Ramachandran plot terbaik dengan residu di area yang paling disukai sebesar 95,8% dan diikuti oleh nilai ERRAT sebesar 89,83% serta 3D Verify sebesar 71,93%. Simulasi penambatan molekuler fragmen faktor C dengan tiga ligan yaitu diposphoryl lipid A, core lipid A dan kdo2 lipid A dapat menjadi aktivator protein fragmen faktor C dengan mengikat daerah reseptor untuk membentuk kompleks reseptor-ligan lipid A. Simulasi dinamika molekuler untuk evaluasi stabilitas interaksi protein dengan ligan (lipid A) pada ketiga kompleks/model menunjukkan bahwa kompleks 2 (fragmen faktor C-diposphoryl lipid A) adalah model yang paling stabil diikuti masing-masing oleh model 3 dan 1. Vektor ekspresi pPIC9K yang membawa gen fragmen faktor C telah berhasil ditransformasikan ke dalam sel inang Escherichia coli DH5α. Plasmid rekombinan pPIC9K-fragmen faktor C juga telah berhasil ditransformasi ke dalam sel inang P. pastoris GS115 dengan ditunjukkan beberapa koloni yang tumbuh pada media YPD. Perlakuan senyawa inducer metanol 1% (v/v) pada kultur transforman P. pastoris GS115 dengan inkubasi 30 oC selama 72 jam secara optimal dapat menginduksi ekspresi protein fragmen faktor C. Protein fragmen faktor C terkonfirmasi memiliki berat molekul 18.6 kDa melalui SDS-PAGE. Fragmen faktor C memiliki aktivitas proteolitik berdasarkan hasil analisis zimogram dan aktivitas proteolitik berkorelasi dengan waktu tumbuh dari P. pastoris GS115 rekombinan.