Identifikasi Gen TBL3, SRY, dan Pengembangan Marka Molekuler serta Potensi Aplikasinya untuk Deteksi Jenis Kelamin Tanaman Salak (Salacca zalacca)

Abstract

Salak (Salacca zalacca) adalah tanaman buah tropika yang umumnya bersifat diosius dengan bunga betina dan jantan terletak pada individu yang berbeda. Tanaman S. Zalacca var. amboinensis adalah ditemukan di provinsi Bali dan memiliki bunga Salak Bali. Deteksi jenis kelamin tanaman salak pada tahap pertumbuhan vegetatif sulit dilakukan karena fenotipe yang serupa. Beberapa metode deteksi dini jenis salak betina, jantan, dan salak Bali tersebut telah dikembangkan, misalnya metode berbasis sitologi, namun metode tersebut belum dapat membedakan di antara ketiganya. Metode molekuler untuk deteksi jenis kelamin salak yang telah dikembangkan antara lain marka RAPD dan SCAR spesifik tanaman jantan, serta marka SCAR spesifik salak betina. Metode molekuler tersebut tidak melibatkan tanaman salak Bali. Pada penelitian ini, digunakan gen transducin beta like-3 (TBL3) dan sex determining region Y (SRY) untuk identifikasi single nucleotide polymorphism (SNP) yang selanjutnya dimanfaatkan untuk pengembangan marka single nucleotide amplified polymorphism (SNAP). Karena keterbatasan informasi genomik tanaman salak pada pangkalan data DNA, maka digunakan sekuens gen TBL3 dan SRY tanaman kurma yang berkerabat dekat dengan tanaman salak. Selain dua primer yang yang diperoleh dari literatur yang dapat mengamplifikasi tanaman kurma, didesain juga tiga pasang primer untuk mengamplifikasi gen TBL3 tanaman salak. Tiga dari lima pasang primer spesifik TBL3 yang digunakan dapat mengamplifikasi genom tanaman salak betina, jantan, dan Salak Bali. Analisis filogenetik memperlihatkan sekuen TBL3 tanaman salak dengan 11 species tanaman lain memperlihatkan kedekatan hubungan TBL3 salak dengan TBL3 tanaman kurma dan kelapa sawait. Multiple sequence aligment yang dilakukan pada region TBL3_3F-TBL3_3R (sepanjang ~500 bp) memperlihatkan 11 SNP yang terdiri dari mutasi, transversi, dan insersi/delesi (Indel). Kesemua SNP pada region TBL3_3F-TBL3_3R bersifat intronik. Region TBL3_5F-TBL3_5R (sepanjang ~1000 bp) berhimpitan dengan TBL3_7F-TBL3-7R (sepanjang 700 bp) memperlihatkan tiga belas SNP, baik berupa mutasi translasi, transversi, dan InDel. Tujuh dari tiga belas SNP pada region TBL5_3F-TBL3_5R bersifat eksonik dan sisanya intronik. Pengembangan marka SNAP pada masing-masing posisi SNP region TBL3_5F-TBL3_5R menghasilkan tujuh set marka. Hasil validasi set marka STBL1_1FRef-STBL1_1Rev spesifik untuk tanaman Salak Bali, sedangkan STBL1_1FAlt-STBL1_1Rev spesifik untuk tanaman betina dan jantan. Amplifikasi gen SRY pada tanaman salak diperoleh dengan primer SRY7F-SRY7R menghasilkan sekuens sepanjang ~500 bp. MSA pada sampel tanaman salak betina, Salak Bali, dan jantan menunjukkan delapan SNP. Sebanyak total delapan set marka SNAP dikembangkan untuk masing-masing posisi SNP. Hasil validasi menunjukkan primer SNAP SSRY_2F – SSRY_1R spesifik untuk tanaman salak Salak Bali, sedangkan SSRY_2Falt – SSRY_1R spesifik untuk tanaman salak betina dan jantan. Analisa jenis kelamin pada benih salak yang berasal dari biji dilakukan menggunakan set marka STBL1 serta marka SCAR spesifik jantan. Sebelum diuji pada sampel, marka SCAR divalidasi pada total 30 tanaman dewasa. Semua biji salak dengan berbagai morfologi diketahui mulai tumbuh bersamaan pada hari ke-5 setelah disemai. Berdasakan Analisa molekuler dan uji Chi Square diketahui bahwa morfologi biji, yaitu ujung embrio, struktur 'sabuk', dan bentuk abaksial biji tidak merujuk pada jenis kelamin tertentu.