Analisis Ekspresi Kandidat Gen Penyandi Enzim Pendegradasi Pektin pada Proses Pematangan Buah Cabai (Capsicum annuum L.).

Abstract

Buah cabai matang rentan terhadap pelunakan ketika pascapanen. Pelunakan buah terjadi secara alami karena proses pematangan yang melibatkan degradasi berbagai komponen dinding sel, khususnya pektin, oleh banyak enzim. Berbagai penelitian telah melaporkan kandidat gen yang diduga berperan dalam proses pematangan buah pada beberapa varietas cabai yaitu polygalacturonase (PG), pectinesterase2 (PE2), polygalacturonase inhibiting protein (PIP), betagalactosidase (BG), ripening inhibitor (RIN), dan expansin1 (EXP1). Hal tersebut menunjukkan bahwa kompleks multigen mengatur mekanisme pematangan dan pelunakan buah cabai. Penelitian sebelumnya menunjukan bahwa cabai SSP memiliki kemampuan daya simpan yang lebih baik dibandingkan cabai varietas lokal lainnya yaitu Princess dan Kopay. Hal ini dibuktikan dengan tingkat persentase susut bobot buah yang rendah pada buah cabai SSP dibandingkan varietas uji lainnya. Sebagai varietas dengan sifat ketahanan daya simpan yang tinggi, cabai SSP dapat digunakan sebagai objek untuk mengungkap informasi mengenai regulasi molekuler terkait degradasi pektin, sebagai upaya untuk memahami proses pematangan buah cabai secara molekuler. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil ekspresi dari kandidat gen penyandi enzim yang terlibat dalam metabolisme pektin dan mengukur konsentrasi pektin pada buah cabai hijau dan merah. Preparasi sampel dilakukan dengan pemanenan buah matang hijau dan buah merah dari tiga varietas cabai Indonesia, yaitu Kopay dengan Laris (cabai tidak tahan simpan), dan SSP (cabai tahan simpan). Masing-masing buah dipanen pada waktu 35 dan 55 hari setelah antesis. Metode penelitian ini terdiri dari tiga bagian: (1) analisis bioinformatik untuk memperoleh informasi sekuen gen target dan housekeeping gene dengan database Sol Genomics Network. Sekuen yang dipilih, dilanjutkan ketahap perancangan primer dengan aplikasi Primer3. (2) analisis ekspresi gen. Sampel buah segar diekstraksi untuk memperoleh RNA total. Sepuluh kandidat gen: pectinesterase1 (PE1), pectinesterase2 (PE2), pectate lyase (PL), pepper beta-galactosidase1 (PBG1), beta-galactosidase (BG), polygalacturonase (PG), pepper polygalacturonase1 (PPG1), polygalacturonase inhibiting protein (PIP), ripening inhibitor (RIN), dan expansin (EXP1) dianalisis ekspresinya dengan menggunakan quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Tiga housekeeping gene (HKG) yaitu GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), UB (ubiquitin), dan TUB (alpha-tubulin) diseleksi untuk memperoleh HKG ideal yang kemudian digunakan sebagai gen penormalisasi dalam analisis ekspresi gen. (3) analisis kandungan pektin. Buah cabai beku diekstraksi dan dikering bekukan. Ekstrak pektin kering beku diukur menggunakan kit pectin identification assay dari Megazyme. Pada penelitian sebelumnya, SSP menunjukkan keterlambatan pelunakan buah pascapanen. Tingkat persentase susut bobot buah cabai pascapanen adalah indikator yang menunjukan perbedaan antara buah cabai tahan simpan dengan viii buah cabai tidak tahan simpan pascapanen. Berdasarkan hasil pengamatan persentase susut bobot buah mengungkapkan bahwa cabai SSP memiliki tingkat ketahanan daya simpan yang lebih baik dibandingkan dengan cabai varietas pembanding lainnya, yaitu Kopay (78,97%) dan Laris (76,87%) dengan ditandai persentase susut bobot buah yang signifikan lebih tinggi dibandingkan SSP (49,57%). HKG GAPDH digunakan untuk menormalisasi nilai ekspresi dari kandidat gen. Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen PG, PPG1, PE2, PIP, EXP1, RIN, BG, dan PBG1 mengalami peningkatan ekspresi pada pematangan buah merah diketiga varietas yang diuji. Terdapat empat gen yang memiliki regulasi ekspresi yang membedakan antara kelompok cabai tahan simpan (SSP) dan kelompok cabai tidak tahan simpan (Kopay dan Laris) yaitu PG, PE2, PIP, dan BG. Analisis pektin menunjukan bahwa kandungan pektin tetap pada tingkat yang sama pada buah SSP matang hijau dan matang merah. Sebaliknya, kadar pektin menurun selama tahap pematangan buah Kopay dan Laris. Penelitian ini menggunakan analisis hierarchical cluster analysis (HCA) dan principal component analysis (PCA) untuk membandingkan data ekspresi gen dari varietas cabai SSP dengan Kopay dan Laris. Hasil HCA mengungkapkan bahwa buah cabai merah dari varietas SSP terpisah pada kluster yang berbeda dengan cabai merah Kopay dan Laris. Hal ini menjelaskan bahwa terdapat perbedaan regulasi ekspresi gen penyandi enzim metabolisme pektin pada buah cabai kelompok tahan simpan dengan tidak tahan simpan. Hasil analisis PCA mengungkapkan bahwa Kopay tahap pematangan buah merah dan Laris tahap pematangan buah merah sangat dipengaruhi oleh ekspresi gen EXP1, PG, PBG1, RIN, dan PPG1. SSP pada tahapan buah merah berasosiasi kuat dengan BG, PIP, dan PE2. Kopay dan Laris tahap pematangan buah hijau dipengaruhi oleh ekspresi PE1 dan kandungan pektin. Selanjutnya, SSP tahap buah hijau sangat berasosiasi dengan ekspresi gen PL. Untuk menilai apakah hasil analisis ekspresi gen dan kandungan pektin berkorelasi, dilakukan analisis korelasi Pearson. Analisis menunjukkan bahwa PG, PPG1, PE2, PIP, EXP1, RIN, BG, dan PBG1 berkorelasi negatif dengan kandungan pektin di semua sampel, menunjukkan bahwa tingginya ekspresi kedelapan gen tersebut berkorelasi dengan rendahnya kadar pektin selama pematangan buah. Hasil ini memberikan wawasan tentang regulasi molekuler degradasi pektin dalam buah cabai. Data korelasi ekspresi gen dan kandungan pektin selama pematangan buah berguna untuk mengembangkan varietas cabai baru yang berfokus pada perpanjangan umur simpan buah dengan menggunakan kedelapan gen tersebut (terutama PG, PE2, dan PIP) sebagai penanda atau target untuk modifikasi genetik.

Ripe pepper fruits are vulnerable to softening at post-harvest. Fruit softening occurs naturally due to the ripening process involving cell wall component degradation, particularly pectin, by several enzymes. Various studies have reported candidate genes that are thought to play a role in fruit ripening in several pepper varieties, i.e. polygalacturonase (PG), pectinesterase2 (PE2), polygalacturonase inhibiting protein (PIP), beta-galactosidase (BG), ripening inhibitor (RIN), and expansin (EXP1). This result indicates that a multigene complex regulates the ripening and softening mechanism of pepper fruits. Previous studies have revealed that the SSP pepper variety has a longer shelf-life compared to other local varieties such as Princess and Kopay. This is because SSP pepper has a lower percentage of fruit weight loss. Due to its longer shelf-life, SSP pepper can be used as an object to unravelling the molecular regulation of pectin degradation in pepper fruits for understanding the ripening process of pepper fruits. Therefore, this study aimed to profile the relative expressions of candidate genes encoding enzymes involved in pectin metabolism and to measure the pectin concentration in unripe and ripe pepper fruits. Unripe and ripe fruits of three Indonesian pepper varieties, i.e. Kopay, Laris (short shelf-life), and SSP (long shelf-life) were harvested at 35 and 55 days after anthesis. This research method consists of three parts: (1) bioinformatic analysis was performed to obtain information on target gene sequences and housekeeping genes using Sol Genomics Network database. From obtained sequences, primers were designed using the Primer3 application. (2) analysis of gene expression. Fresh fruit samples were extracted for total RNAs. Ten candidate genes: pectinesterase1 (PE1), pectinesterase2 (PE2), pectate lyase (PL), pepper beta-galactosidase1 (PBG1), beta-galactosidase (BG), polygalacturonase (PG), pepper polygalacturonase1 (PPG1), polygalacturonase inhibiting protein (PIP), ripening inhibitor (RIN), and expansin (EXP1) were analyzed for their expressions using quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) technique. For precise gene expression analysis, three housekeeping genes (HKG): glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), ubiquitin (UB), and alpha-tubulin (TUB) were studied to determine the most suitable HKG to use as a normalization gene. (3) pectin content analysis. The pepper fruit was freeze-dried and pectin was extracted. The freeze-dried pectin extract was measured using pectin identification assay kit from Megazyme. In the previous study, SSP showed a delay in fruit softening after postharvest. The weight lost by peppers after harvesting can indicate how long they will last on the shelf. Our findings showed that SSP peppers (49.57%) have a longer shelf-life compared to other varieties like Kopay (78.97%) and Laris (76.87%). A HKG, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), was used to normalize the relative expression values of the candidate genes. The results showed that expressions of PG, PPG1, PE2, PIP, EXP1, RIN, BG, and PBG1 x were increased during ripe fruits in three varieties. Four genes differentiated expression regulation between long shelf-life pepper (SSP) and short shelf-life peppers (Kopay and Laris), namely PG, PE2, PIP, and BG. Pectin analysis revealed that pectin content has stayed at the same levels in unripe and ripe fruits of SSP. In contrast, pectin levels decreased during fruit ripening in Kopay and Laris. The study used hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) to examine the differences between SSP compared to Kopay and Laris peppers. The HCA results showed that peppers in the long and short shelflife groups have different gene expression regulation of pectin metabolizing enzymes. The PCA analysis revealed that expression of EXP1, PG, PBG1, and PPG1 genes strongly influenced in ripe fruit of Kopay and Laris, whereas the ripe fruit of SSP was associated with BG, PIP, and PE2. Kopay and Laris unripe fruit are influenced by PE1 and pectin content. The unripe fruit of SSP associated with PL gene expression. To assess whether the gene expression analysis and pectin content results were correlated, Pearson correlation analysis was performed. The analysis showed that PG, PPG1, PE2, PIP, EXP1, RIN, BG, and PBG1 were negatively correlated with pectin content in all samples, suggesting that high expressions of those genes correlate with low levels of pectin during fruit ripening. Our results give an insight into the molecular regulation of pectin degradation in pepper fruits. Correlation data of gene expression and pectin levels during fruit ripening is useful for developing new pepper varieties focusing on extending fruit shelf-life using those eight genes (especially PG, PE2, and PIP) as markers or targets for genetic modification.