Pengaruh Krioprotektan dan Metode Penyingkirannya terhadap Viabilitas Embrio Beku Mencit

Abstract

Ketahanan dan kelangsungan hidup embrio dalam produksi dan pemanfaatan embrio beku sangat tergantung pada krioprotektan yang dipergunakan dalam proses pembekuan dan metode penyingkiran krioprotektan yang bersangkutan dalarn proses pencairan kembali embrio beku tersebut. Suatu penelitian telah dilaksanakan pada 432 ernbrio mencit berkualitas baik (layak beku) serta berada pada stadium morula dan blastosis untuk menguji dan membuktikan keabsahan pernyataan ini. Penelitian dirancang secara kelompok dengan pola faktorial yang terdiri alas dua faktor, yakni jenis krioprotektan dan metode penyingkirannya dari sel embrio. Krioprotektan terdiri alas tiga jenis, yaitu 1.5 M gliserol, 1.5 M etilen glikol dan 1.5 M propanediol di dalam modified phosphate buffer saline solution (mPBS) + 10 persen foetal bovine serum (FBS); sedangkan metode penyingkiran juga terdiri alas tiga taraf, yakni bertahap tanpa sukrosa, bertahap dengan sukrosa dan metode langsung. Prosedur kriopreservasi dimulai dengan memaparkan embrio-embrio tersebut secara bertahap (masing-masing tahap membutunkan waktu 10 menit) dalam salah satu krioprotektan di alas dan diisi ke dalam 0.25 ml ministraw. Setelah itu, ministraw tersebut dimasukkan ke dalam .• mesin pembekuan yang suhunya telah diturunkan menjadi -6.5°C. Tiga menit kemudian dilakukan seeding dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu tersebut. Deng an kecepatan pendinginan 0.3°C per menit, suhu diturunkan menjadi -35°C, kemudian ministraw dicemplungkan ke dalam nitrogen cair yang bersuhu -196°C dan disimpan di dalam kontainer. Seminggu kemudian, ministraw tersebut dikeluarkan dari kontainer dan dicairkan kembali di dalam penangas air yang bersuhu 37°C selama 25 detik. Setelah itu dilakukan penyingkiran krioprotektan dari sel embrio dengan menggunakan salah satu metode di alas. Metode bertahap tanpa sukrosa dilaksanakan dengan memindahkan embrio secara berturut-turut ke dalam krioprotektan yang sama pada konsentrasi 1.0 M, 0.5 M, dan 0.0 M; metode bertahap dengan sukrosa, embrio dipindahkan secara berturutturut ke dalam 0.75 M + 0.5 M sukrosa, 0.5 M sukrosa, dan 0.0 M sukrosa; sedangkan metode langsung dilakukan di dalam ministraw dengan jalan mencampur larutan sukrosa yang terdapat pada kedua ujung ministraw dengan krioprotektan yang berisi embrio pada bagian tengah ministraw tersebut. Setiap tahapan konsentrasi membutuhkan waktu 10 menit. Swvival rate diamati sesaat setelah penyingkiran krioprotektan, sedangkan viabilitas embrio diukur setelah kultur 24 jam dalam mPBS + 10 persen FBS yang disimpan di dalam inkubator CO2 pada suhu 37 derajat Celcius. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa etilen glikol memiliki daya krioprotektif yang lebih baik dalam mempertahankan viabilitas embrio beku mencit dibandingkan dengan gliserol dan propanediol, sedangkan metode penyingkiran terbaik dicapai oleh metode bertahap dengan sukrosa. Dari ketiga metode penyingkiran yang dirancang untuk diterapkan secara aplikatif di lapangan, kriopreservasi embrio dalam etilen glikol dan penyingkirannya dengan menggunakan metode langsung menghasilkan survival rate dan viabilitas embrio tertinggi.