Aktivitas antibakteri enzim protease dari kapang endofit laut Xylaria psidii KT30 dan deteksi gen penyandinya

Abstract

Penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri menjadi masalah serius bagi kesehatan masyarakat dalam beberapa tahun terakhir. Meskipun obat antibakteri yang ada telah cukup efektif, tetapi tidak menutup kemungkinan timbulnya resistensi terhadap obat tersebut. Eksplorasi senyawa bioaktif (protein) baru dari alami saat ini sudah mulai diteliti secara intensif dalam beberapa dekade terakhir Tujuan penelitian ini adalah menentukan aktivitas antibakteri protein kapang endofit laut Xylaria psidii KT30, aktivitas antibakteri protease dan deteksi gen penyandi proteasenya. Penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahapan diantaranya optimasi produksi protease, purifikasi protein X. psidii KT30, penentuan bobot molekul protein dengan SDS-PAGE dan zymogram, uji aktivitas antibakteri protease serta deteksi gen yang menyandikan antibakteri protease dengan nested PCR. Kultur yang dilakukan pada 2 media berbeda menghasilkan perbedaan dalam bobot kering miselia, nilai pH dan aktivitas protease. Media Hagem pada kultur hari ke-15 menghasilkan nilai bobot kering tertinggi dengan nilai 0,1419±0,01 gram, sementara media PDB menghasilkan bobot kering 0,1233±0,01 gram pada hari ke-9 dengan volume media kultur 50 mL. Penurunan pH terjadi akibat proses fermentasi dengan rentang pH pada media Hagem 3,17±0,09 - 3,60±0,17 dan pada media PDB 5,12±0,50 - 5,72±0,07. Aktivitas tertinggi protease didapatkan pada hari ke-15 dengan nilai 2,33±0,19 U/mL pada media PDB, sedangkan pada media Hagem aktivitas tertinggi didapatkan pada kultur hari ke-18 dengan nilai 0,484±0,03 U/mL. Kadar protein tertinggi media PDB didapatkan pada kultur hari ke-15 dengan nilai konsentrasi protein 2,82 mg/mL pada filtrat media dan 2,43 mg/mL setelah presipitasi menggunakan (NH4)2SO4 90%, sementara pada media Hagem hasil konsentrasi tertinggi didapatkan pada hari ke-21 dengan nilai 1,62 mg/mL pada filtrat media dan mengalami kenaikan konsentrasi dengan nilai 1,88 mg/mL setelah tahap presipitasi. Purifikasi menggunakan Sephadex G75 menunjukkan setiap fraksi gabungan memiliki konsentrasi protein yang berbeda. Nilai konsentrasi berurutan pada fraksi 5-8, 9-12 dan 13-15 adalah 0,75; 0,15; 0,97 mg/mL. Hasil SDS–PAGE menunjukkan bobot molekul hasil fraksinasi protein yaitu fraksi 5-8 memiliki bobot molekul 56,62, 89,12 dan 162,18 kDa, sedangkan fraksi 9-12 menunjukkan protein dengan bobot molekul 162,18 kDa. Hasil zymogram fraksi 5-8 menunjukkan ukuran band protease berukuran 42,6 kDa dan 81,9 kDa. Protease dengan bobot molekul 103,5 kDa yang muncul di SDS-PAGE ditunjukkan oleh fraksi 9-12. Hasil karakterisasi enzim pada pH menunjukkan aktivitas protease optimum pada pH 9 untuk fraksi 5-8 dengan nilai 1,243 U/mL, sedangkan pada fraksi 9-12 menunjukkan aktivitas optimum pada pH 7 dengan nilai 2,587 U/mL. Karakterisasi suhu menunjukkan aktivitas protease optimum pada suhu 70oC pada fraksi 5-8 dengan nilai 1,341 U/mL, sedangkan fraksi 9-12 menunjukkan aktivitas protease optimum pada suhu 60oC dengan nilai 1,147 U/mL. Hasil karakterisasi pada surfaktan dan logam menunjukkan bahwa EDTA, PMSF, SDS, urea dan tween-20 mampu menghambat aktivitas relatif dari protease, sedangkan DTT, CaCl2 dan MgCl2 cenderung menaikkan aktivitas protease. Aktivitas protein ekstraseluler hasil pengendapan amonium sulfat 90% menunjukkan hasil yang positif dalam menghambat patogen Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus. Hasil isolasi DNA dari miselia X. psidii KT30 memiliki nilai rasio OD260/OD280 1,820. Gen penyandi protease diamplifikasi menggunakan nested PCR dengan primer SPKT30_F/R menghasilkan pita dengan ukuran ± 150 bp. Sekuensi dan analisis BLAST menunjukkan sekuen pita ini memiliki nilai identity 100% dengan beberapa jenis protease dari fungi lainnya diantaranya proteinase R Tritirachium album (X56116.1), serin protease Arthrobotrys conoides AY859782.1, serin protease ekstraseluler (PII) Duddingtonia flagrans strain 1351 AY444725.1, serin protease (SPR1) Monacrosporium haptotylum EF681769.1 dan serin protease Thermoascus aurantiacus var. levisporus EU364816.1.