DNA Barcoding Berbasis Penanda Rbcl Pada Tumbuhan Air Di Wilayah Rote Ndao, Pulau Rote, Nusa Tenggara Timur

Abstract

Pulau Rote terletak pada 100 25'-110 00' Lintang Selatan dan 1210 49'- 1230 26' Bujur Timur. Di wilayah Rote Ndao terdapat 96 pulau, dan hanya enam di antaranya yang berpenghuni. Hasil ekspedisi tim Oe Rote tahun 2018 yang menggabungkan survei terestrial dan citra satelit mengungkapkan bahwa terdapat 82 danau di Pulau Rote yang 24 diantaranya merupakan danau air asin. Sebanyak 24 danau air asin dan 2 danau air tawar terdapat di kawasan Laut Mati Rote. Di antara danau tersebut terdapat lima danau yang digunakan untuk penelitian ini yaitu Danau Ledulu, Oendui, Oemasapoka, Oesotimori dan Landu Leko. Danau Ledulu dan Oendui merupakan danau air tawar. Oemasapoka merupakan danau air asin dengan tingkat salinitas yang bervariasi antara 45-50 ppt. Selain itu, terdapat Oesotimori yang memiliki tingkat salinitas lebih dari 100 ppt. Landu leko merupakan wilayah laut yang memisahkan Pulau Rote Barat dengan Pulau Rote Timur, yang mengalami pengeringan air asin danau. Hal ini ditandai dengan kondisi tanah yang hampir kering pada musim kemarau, dan kondisi tanah yang mengandung air pada musim hujan. Di danau-danau tersebut tumbuh beragam tumbuhan air yang berperan sebagai bagian dari ekosistem danau. Tumbuhan air tersebut sampai saat ini belum teridentifikasi dengan baik. Identifikasi spesies tumbuhan air dapat dilakukan baik secara morfologi maupun secara molekuler menggunakan pendekatan DNA barcoding. Namun penggunaan identifikasi secara molekuler DNA barcoding dalam menganalisis lebih cepat dan tepat. Dalam identifikasi molekuler DNA barcoding diperlukan penanda genetik. Consortium for the Barcode of life (CBOL), melaporkan bahwa penanda rbcL (Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase–oxygenase large subunit) merupakan penanda utama dalam penandaan tumbuhan, ideal dalam studi filogenetik dan taksonomi tumbuhan, bersifat universal, serta mudah diamplifikasi dan dianalisis. Spesies tumbuhan air di Pulau Rote terutama yang berasal dari lima danau yang berbeda belum pernah diteliti untuk molekuler DNA barcoding. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mempelajari keragaman spesies-spesies tumbuhan air yang tumbuh di danau sekitar Rote Ndao, Pulau Rote, Nusa Tenggara Timur menggunakan penanda rbcL. Pengambilan sampel tumbuhan air sebanyak 20 spesies dilakukan di Danau Ledulu, Oendui, Oemasapoka, Oesotimori dan Landu Leko. Provinsi Nusa Tenggara Timur Kabupaten Rote Ndao. Identifikasi morfologi tumbuhan air dilakukan di Laboratorium Botani Pusat Riset Biologi–BRIN Cibinong. Identifikasi molekuler dilakukan dengan menggunakan penanda rbcL. Isolasi DNA total menggunakan kit Genomic Plant DNA extraction (Intron Biotechnology, Korea). DNA hasil isolasi diamplifikasi menggunakan primer rcbL dengan forward (F) dan reverse (R) yaitu rbcL F (ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA) dan rbcL R (GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG). Volume PCR yang digunakan adalah 50 µl yang terdiri dari Green taq 1 x PCR master mix (Biogen, USA) sebanyak 25 µl, DNA 5 µl (154 µg/mL), primer forward dan reverse masing-masing sebanyak 2,5 µl (0,5 µM) dan ddH2O 15 µl. Tahapan PCR yang digunakan yaitu pre-denaturasi 95 °C (5 menit) dilanjutkan

dengan 45 siklus denaturasi 94 °C (1 menit), annealing 52 °C (1 menit 30 detik), dan extension 72 °C (1 menit), kemudian diakhiri dengan final extension 72 °C (10 menit). Hasil produk PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% dalam buffer TBE 1x dengan voltase 120 volt selama 25-30 menit, kemudian didokumentasikan menggunakan Gel Doc System AlpaImager (Protein Simple, USA). Perunutan (sequencing) DNA dikirim kepada jasa perusahaan sekuensing DNA First Base Singapore. Proses menghasilkan nukleotida sekuen menggunakan mesin Applied Biosystems (AB) PRISM 3000 genetic analyzer (Thermo Scientific, USA). Hasil dari sekuensing DNA diedit menggunakan perangkat lunak Bioedit versi 7. Jarak genetik ditentukan menggunakan model Kimura 2 parameter pada perangkat lunak MEGA versi 7. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan menggunakan metode Bayesian Inference pada program MrBayes versi 3.1.2. dengan bootstrap 1000 ulangan. Analisis keragaman nukleotida menggunakan perangkat lunak DnaSP versi 6. FCA (Factorial Component Analysis) dilakukan dengan algoritma PROXSCAL dari MDS (Multidimensional Scaling) menggunakan software SPSS (Statistical Package for Social Sciences) versi 26. DNA barcoding menggunakan penanda rbcL efisien diterapkan untuk identifikasi molekuler tumbuhan air di wilayah Rote Ndao, Pulau Rote, Nusa Tenggara Timur. Panjang untaian DNA adalah 508-561 pb menggunakan penanda rbcL. Sebanyak 20 sekuen tumbuhan air dari Danau Ledulu (13 sampel), Oendui (2 sampel), Oemasapoka (3 sampel), Oesotimori (1 sampel), dan dari lahan basah Landu Leko (1 sampel) telah teridentifikasi jenis tumbuhan air dari masing- masing danau pada database NCBI (National Centre for Biotechnology Information). Pencarian homologi sekuen rbcL dilakukan menggunakan perangkat pencarian BLAST (Basic Local Alignment search tool) dengan hasil pencarian menunjukkan Query cover 97-100%, Percent identity (Perc. ident) 97- 99,82%, dan E-value nol (0). Hasil analisis filogenetik menunjukkan ke dua puluh spesies tumbuhan mengelompok ke dalam tiga grup utama yang terdiri dari grup 1 memiliki lima spesies, grup 2 terdapat tujuh spesies dan grup 3 terdapat delapan spesies tumbuhan air dengan nilai boostrap yang tinggi yaitu 53-100%. Pada analisis filogenetik tumbuhan air menggunakan penanda rbcL dan metode Bayesian Inference berhasil memisahkan dengan cukup baik antar famili meskipun terdapat dua spesies tumbuhan air dengan famili yang berbeda berada dalam satu percabangan yang sama. A. macrostachyum dan L. adscendens. Hasil analisis FCA terdapat tiga grup dengan pembagian spesies yang sama dengan hasil analisis filogenetik. Kekerabatan suatu spesies tidak hanya dilihat dari kesamaan genus dan famili tetapi juga kesamaan jumlah sekuen dari spesies tersebut seperti yang terjadi pada spesies O. alismoides dan O. cordata, kedua spesies tersebut memiliki genus dan famili yang sama akan tetapi memiliki jarak yang berjauhan. Perbedaan terjadi pada spesies P. korsakowii dan P. vaginalis keduanya memiliki genus dan famili yang sama dan memiliki jarak yang berdekatan. Kedua Hal tersebut dapat terjadi karena pada genus Ottelia memiliki jumlah kesaaman sekuen yang sedikit sehingga kedua spesies memiliki jarak yang berjauhan sedangkan pada genus Potenderia memiliki jumlah sekuen yang hampir sama sehingga jarak yang dimiliki berdekatan Hasil analisis keragaman nukleotida pada penanda rbcL memiliki nilai polymorphic site 191. Singleteon site dan parsimony site berturut-turut 61 dan 130. Keragaman nukleotida yang dimiliki

adalah tidak lebih dari 0,1 sedangkan keragaman haplotipenya adalah 1,0. Nilai haplotipe 1,0 menandakan bahwa spesies yang terdapat pada penelitian ini berbeda-beda.