Karakterisasi parsial gen penyandi putresina N-metiltransferase: enzim kunci dalam biosintesis nikotin pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum)

Abstract

Penggunaan teknologi marka DNA dalam mendukung program pemuliaan tanaman memungkinkan seleksi pada tingkat DNA dan dilakukan pada stadia awal pertumbuhan tanaman. Marka DNA berbasis SNP (Single Nucleotide Polimorphisms) mulai banyak digunakan pada studi-studi genetika karena ketersediaannya yang melimpah dalam genom tanaman. SNAP (Single Nucleotide Amplification Polimorphisms) adalah salah satu dari teknologi marka DNA untuk mendeteksi putatif SNP menggunakan primer alel spesifik. Pengembangan marka DNA berbasis SNP sebagai alat bantu seleksi pada populasi tembakau lokal, membutuhkan informasi keragaman runutan basa dan situs-situs SNP dari sekuen gen PMT penyandi enzim putresina N-metiltransferase yang terkait dengan biosintesis nikotin. Amplifikasi fragmen gen PMT asal tembakau lokal Indonesia adalah tahapan awal dari isolasi gen PMT. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa tiga pasang kombinasi primer degenerate menghasilkan reaksi PCR positif, tetapi hanya satu pasang primer yang menghasilkan fragmen tunggal, yaitu PMt-7 (F & R). Sekuen fragmen gen PMT asal DNA genom yang meliputi ekson2-ekson8 memiliki ukuran 1418 pb (pasang basa) dengan panjang daerah ekson 767 pb dan menyandikan 256 aa (asam amino) residu. Sekuen gen PMT asal DNA genom varietas Sindoro1 mempunyai tingkat kesamaan yang tinggi (95%) dengan gen PMT asal DNA genom tembakau lainnya yang ada di pangkalan data GenBank NCBI. Sekuen parsial gen PMT ini telah terdaftar pada GenBank dan dipublikasikan dengan nomor aksesi JQ438825. Untuk mengkonfirmasi ekspresi dari gen PMT asal tembakau lokal yang telah diidentifikasi, amplifikasi PCR dilakukan menggunakan cetakan cDNA. Hasil konfirmasi memperlihatkan bahwa sekuen kandidat gen Ntpmt_Sindoro1 yang meliputi ekson1-ekson8 tersusun atas 1124 pb dan menyandikan protein yang dibangun oleh 374 aa. Protein Ntpmt-Sindoro1 bersifat terlarut dan memiliki berat molekul 40.95 kD. Sekuen protein dari Ntpmt-Sindoro1 memiliki tingkat kesamaan 90% dengan sekuen protein dari gen-gen PMT lainnya yang berasal dari N. tabacum. Runutan asam amino dari Ntpmt-Sindoro1 juga memiliki ciri-ciri..dst