Kloning dan Transformasi Gen Alanin Aminotransferase untuk Perbaikan Efsiensi Penggunaan Nitrogen Pada Tanaman Padi

Abstract

Padi merupakan salah satu sumber pangan di dunia. Upaya meningkatkan produksi padi terus dilakukan untuk mengimbangi laju peningkatan kebutuhan beras. Pupuk N dalam bentuk urea sudah menjadi kebutuhan pokok bagi petani padi khususnya di Indonesia karena dianggap dapat langsung meningkatkan produktivitas sehingga terjadi pemborosan dalam pemakaian urea di petani. Dosis pemberian pupuk urea yang cukup tinggi di petani di Indonesia saat ini ada yang mencapai 400−600 kg ha-1 di atas rekomendasi pemerintah sebesar 200–260 kg ha-1. Nitrogen sifatnya sangat mobil di dalam tanah dan tanaman hanya mampu menggunakan sekitar 30-40% dari nitrogen yang tersedia. Lebih dari 60% nitrogen tanah hilang melalui kombinasi proses pencucian, limpasan (surface runoff), denitrifikasi, volatisasi dan oleh konsumsi mikroba tanah. Teknik rekayasa genetika merupakan salah satu strategi yang dapat ditempuh untuk merakit tanaman padi yang secara efisien dapat menggunakan pupuk N pada dosis rendah. Salah satu gen yang berfungsi untuk efisiensi N adalah Alanin Aminotransferase (AlaAT). Gen ini terbukti secara efisien dapat meningkatkan biomassa dan hasil panen yang mengindikasikan efisiensi dalam menggunakan nitrogen. Tujuan penelitian ini ialah (1) melakukan isolasi, studi homologi dan konstruksi gen Alanin Aminotransferase dari tanaman barley, hotong, tomat dan mentimun, (2) melakukan optimasi faktor yang mempengaruhi transformasi padi yang dimediasi Agrobacterium tumefaciens pada padi varietas Fatmawati, (3) melakukan transformasi genetik kontruk OsAnt1::AlaAT ke tanaman padi varietas Fatmawati, Inpari 6 dan Nipponbare, (4) melakukan evaluasi fenotipik tanaman padi transgenik Fatmawati generasi T1 terhadap efisiensi penggunaan nitrogen. Gen AlaAT dari tanaman barley, hotong, tomat, dan mentimun telah berhasil diisolasi dan disisipkan pada vektor kloning. Gen AlaAT dari tanaman tomat dan mentimun mempunyai kesamaan asam amino < 80% dengan gen AlaAT barley. Gen AlaAT dari barley, hotong, tomat, atau mentimun telah berhasil dikonstruksi dalam vektor ekspresi tanaman pCAMBIA1300int. Konstruk tersebut telah ditransformasi ke Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 dan digunakan untuk transformasi ke tanaman padi. Optimasi sistem transformasi pada padi varietas Fatmawati telah diperoleh. Penggunaan asetosiringon 100 μM pada media kokultivasi dan higromisin 30 mg/L untuk menyeleksi kalus transforman merupakan konsentrasi yang optimal untuk transformasi genetik padi varietas Fatmawati menggunakan A. tumefaciens dengan efisiensi transformasi sebesar 7.84%. Metode transformasi genetik padi varietas Fatmawati ini digunakan sebagai acuan dalam transformasi dengan menggunakan gen target. Konstruk gen AlaAT telah berhasil diintroduksikan ke tanaman padi varietas Fatmawati, Inpari 6 dan Nipponbare, yang dibuktikan dengan hasil PCR positif untuk keberadaan transgen AlaAT pada tanaman-tanaman hasil transformasi. Modifikasi pada media pre-regenerasi tanpa seleksi dan penambahan periode subkultur dapat meningkatkan efisiensi transformasi padi varietas Fatmawati menjadi 14.8%. Analisis Southern Blot pada galur tanaman padi transgenik Fatmawati menunjukkan jumlah kopi gen hpt yang bervariasi antara 1-4 kopi gen. dst...