Pertumbuhan dan Metabolit Inhibitor α-Glukosidase pada Murbei (Morus sp.) dari Berbagai Agroekologi yang Berbeda di Indonesia yang Toleran Salinitas

Abstract

Salinitas menyebabkan perubahan proses morfo-fisiologis, anatomis, serta biokimia pada tanaman. Cekaman salinitas dapat menurunkan produktivitas serta mengganggu pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Tanaman murbei memiliki mekanisme adaptif dalam mempertahankan proses fisiologis dalam kondisi tercekam dengan cara mengurangi jumlah daun, mengurangi laju fotosintesis, dan akumulasi solut organik yang tinggi di daun. Masih sedikit informasi mengenai toleransi terhadap cekaman salinitas pada aksesi murbei. Pada penelitian ini, berbagai pendekatan digunakan untuk mempelajari dan menggambarkan mekanisme toleransi pada aksesi murbei di bawah kondisi tercekam salinitas berdasarkan respon fisiologis, anatomis, biokimia, metabolomik. Cekaman salinitas juga dapat menginduksi pembentukan metabolit sekunder yang di antaranya berpotensi sebagai obat antidiabetes melalui analisis in vitro aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase dan analisis in silico melalui molecular docking. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan aksesi murbei yang toleran terhadap cekaman salinitas dan memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase. Penelitian ini terdiri dari 4 tahapan utama. Tahapan pertama yaitu analisis pertumbuhan dan fisiologis aksesi murbei yang diperlakukan cekaman salinitas. Tahapan kedua yaitu analisis kerapatan struktur sekretori berupa trikoma cystolith dan trikoma kelenjar daun aksesi murbei pada kondisi tercekam salinitas. Tahapan ketiga yaitu analisis biokimia berupa analisis aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase, kandungan fenol dan flavonoid. Tahapan keempat yaitu analisis metabolomik menggunakan alat UHPLC-Q-Orbitrap HRMS sampel terpilih, kemudian 100 metabolit hasil skrining dianalisis lebih lanjut menggunakan metode molecular docking untuk mengetahui senyawa yang paling berpotensi sebagai inhibitor enzim α-glukosidase. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan cekaman salinitas berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan dan fisiologis tanaman murbei. Konsentrasi NaCl tertinggi (0,4%) menyebabkan penurunan parameter pertumbuhan (jumlah daun, bobot basah dan bobot kering akar dan tajuk), penurunan parameter (fotosintesis, klorofil, kadar air relatif daun dan kadar air relatif media), dan peningkatan kandungan prolin serta gula terlarut. Peningkatan prolin dan kadar gula terlarut seiring dengan peningkatan konsentrasi NaCl merupakan mekanisme osmoregulasi dan osmoprotektan sel-sel tanaman murbei. Sampel 2-3 menunjukkan biomassa dan skor genotipik yang cukup tinggi dibandingkan sampel lainnya. Skor genotipik diukur berdasarkan respon jumlah daun pada konsentrasi NaCl tertinggi (0,4%). Sampel 2-3 juga menunjukkan kemampuan eksklusi Na+ yang ditandai dengan persentase nekrosis terendah dibandingkan sampel lainnya. Kerapatan trikoma daun murbei dipengaruhi oleh interaksi perlakuan salinitas dan aksesi. Aksesi tanaman murbei 2 menunjukkan kerapatan trikoma cystolith dan trikoma kelenjar yang lebih tinggi pada konsentrasi NaCl 0,4% dibandingkan kontrol. Struktur sekretori merupakan organ penyimpan dan dapat berfungsi sebagai tempat sekresi berbagai zat, salah satunya Na+ yang merupakan mekanisme unik tanaman halofit. Meningkatnya kerapatan trikoma pada aksesi toleran diduga sebagai respon adaptasi untuk mencegah kehilangan air yang lebih banyak pada kondisi salin. Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase, serta kandungan total fenol dan flavonoid menunjukkan bahwa sampel 2-3 memiliki aktivitas tertinggi. Cekaman salinitas menginduksi ketidakseimbangan redoks yang diduga mengarah kepada akumulasi senyawa antioksidan dan kandungan senyawa bioaktif pada aksesi yang tercekam garam tinggi. Interaksi antioksidan non-enzimatik seperti fenol dan flavonoid berpengaruh terhadap aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase yang ditunjukkan dengan rendahnya nilai IC50 pada sampel 2-3. Nilai IC50 sampel 2-3 yaitu sebesar 0,59 µg/ml mendekati nilai acarbose sebagai kontrol positif yaitu 0,44 µg/ml. Sampel terpilih 2-3 pada konsentrasi NaCl tertinggi memiliki aktivitas terbaik pada semua analisis biokimia. Sampel terpilih 2-0, 2-1, 2-2, 2-3 kemudian diuji lanjut dengan analisis metabolomik. Sampel 4-2 yang memiliki aktivitas terbaik kedua setelah sampel 2-3 beserta kontrol juga dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui senyawa apa saja yang mengalami perubahan sebagai respon terhadap cekaman salinitas. Sampel 6-3 yang memiliki konsentrasi prolin tertinggi juga dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme fisiologis senyawa prolin terhadap perlakuan cekaman salinitas. Hasil menunjukkan sampel 2-3 pada konsentrasi NaCl tertinggi memiliki kelimpahan senyawa fenol (ferulic acid, eugenitin, gingerdione) dan flavonoid (kuwanon G). Senyawa ini juga menjadi metabolit penanda bagi sampel 2-3. Senyawa 4-O-(α-D-glucopyranosyl) moranoline yang merupakan alkaloid menjadi metabolit penanda bagi sampel 4-2. Kandungan prolin pada sampel 6-3 juga cukup dominan dibandingkan senyawa lainnya, tetapi kandungan prolin sampel 2-3 berdasarkan hasil heat map memiliki kelimpahan terbesar dibandingkan sampel lainnya. Hal ini sesuai dengan peran prolin sebagai osmoregulator dan osmoprotektan pada kondisi tercekam salinitas. Metabolit erucamide dari kelompok lipid merupakan senyawa yang dominan diekspresikan dari penelitian ini. Lipid melindungi sel dan membran kloroplas juga mempertahankan struktur dan fungsi membran dari kerusakan. Interaksi flavonoid, fenol, asam karboksilat dan lipid berperan dalam toleransi terhadap cekaman salinitas. Studi in silico menggunakan metode molecular docking digunakan untuk menganalisis mekanisme inhibisi pada level molekuler. Penelitian ini menggunakan sampel 100 metabolit hasil UHPLC-Q-Orbitrap HRMS yang kemudian ditapis secara virtual menggunakan software PyRx. Hasil penapisan virtual menghasilkan 7 ligan terpilih yang diprediksi memiliki potensi penghambatan terbaik terhadap enzim α-glukosidase. Tujuh ligan terpilih tersebut antara lain resveratol-4’-O-glukuronida, obliquin, morusinol, kuwanon C, morasin C, α-tokoferol, dan 8-prenylnaringenin. Sampel 2-3 memiliki ligan uji terpilih terbanyak antara lain obliquin, morusinol, morasin C, dan resveratrol-4’-O-glukuronida. Empat ligan uji terpilih tersebut merupakan inhibitor kompetitif terhadap reseptor enzim -glukosidase. Ligan uji terpilih terbaik adalah resveratrol-4’-O-glukuronida karena memiliki ΔG paling negatif dibandingkan ligan uji terpilih yang lain, yaitu -9,9 kkal/mol dengan membentuk 6 ikatan hidrogen. Simpulan dari penelitian ini yaitu biomassa, skor genotipik, rasio Na+, persentase nekrosis daun dapat menjadi parameter penentu toleransi terhadap cekaman salinitas aksesi murbei. Aksesi murbei 2 pada konsentrasi NaCl 0,4% (sampel 2-3) sebagai aksesi murbei toleran salinitas karena memiliki biomassa yang tinggi, skor genotipik yang tinggi, rendahnya rasio Na+/K+ serta rendahnya persentase nekrosis daun, sedangkan aksesi murbei 1 sebagai aksesi murbei sensitif terhadap cekaman salinitas karena menunjukkan skor genotipik yang rendah serta persentase nekrosis daun yang tinggi. Aksesi toleran murbei 2 menunjukkan peningkatan kerapatan trikoma sedangkan aksesi sensitif murbei 1 menunjukkan penurunan kerapatan trikoma. Sampel 2-3 menunjukkan nilai IC50, kandungan fenol dan flavonoid terbaik dibandingkan sampel lainnya. Cekaman salinitas pada konsentrasi NaCl 0,4% menginduksi konsentrasi fenol (ferulic acid, eugenitin, gingerdione) serta flavonoid (kuwanon G) pada aksesi murbei 2 yang juga menjadi metabolit penanda bagi aksesi ini. Di antara 100 senyawa metabolit yang dianalisis secara in silico menggunakan metode molecular docking, resveratol-4’-O-glukuronida menunjukkan kelimpahan tertinggi pada sampel 2-3 yang merupakan inhibitor kompetitif terhadap reseptor enzim α-glukosidase. Dengan demikian aksesi murbei 2 asal Bogor merupakan aksesi toleran salinitas dan memiliki aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase terbaik.