Prediksi Fertilitas Spermatozoa Sapi Bali melalui Kajian Seluler, Transkriptomik, dan Pengembangan Piranti Mikrofluida.

Abstract

Sapi bali merupakan sapi asli Indonesia yang memiliki banyak keunggulan, antara lain mudah beradaptasi dengan berbagai jenis pakan, kondisi lingkungan dan iklim yang ekstrim, serta memiliki kondisi reproduksi yang baik. Prediksi fertilitas calon pejantan unggul, termasuk sapi bali, dilakukan melalui Breeding Soundness Examination (BSE). Hal ini dinilai kurang akurat karena belum mampu menggambarkan secara utuh mengenai kompetensi spermatozoa untuk fertilisasi. Hal ini mengakibatkan perlu dilakukannya investigasi komprehensif yang mengaitkan kualitas semen dengan angka konsepsi di lapangan. Indikator penentu potensi fertilitas pejantan adalah melalui pemeriksaan kualitas semen. Evaluasi semen yang umumnya dilakukan secara konvensional belum sepenuhnya mampu mendeskripsi prediksi fertilitas secara tepat dan akurat, sehingga dieksplorasi dengan memanfaatkan kemajuan teknologi, seperti penggunaan Computer-Assisted Sperm Analysis (CASA) hingga perangkat mikrofluida. CASA dapat memeriksa ribuan sel spermatozoa sekaligus dengan lebih akurat dan objektif, bahkan mencakup berbagai parameter uji dalam satu waktu. Perangkat mikrofluida menjadi salah satu alternatif penguji kualitas semen dengan alat dan bahan sederhana, volume sampel kecil, harga terjangkau, waktu singkat, dapat digunakan secara mandiri, dan praktis digunakan di segala tempat. Pengujian kualitas semen secara mendalam hingga tingkat molekuler juga mulai dikembangkan melalui pendekatan teknologi omic yang mampu mengkaji molekul transkripsi dan translasi di dalam spermatozoa. Teknologi ini mampu menyajikan data ekspresi gen untuk memvalidasi fungsi spermatozoa dalam spermatogenesis, fertilisasi, dan perkembangan embrio sebagai parameter fertilitas pejantan. Penggunaan teknologi ini dalam perkembangan industri peternakan telah menjadi metode utama yang dapat diterapkan secara luas untuk memprediksi potensi fertilitas pejantan melalui analisis transkriptom spermatozoa. Penelitian bertujuan untuk 1) mengkaji karakteristik semen sapi bali, 2) menganalisis berbagai parameter kinematic motilitas dan morfologi abnormalitas spermatozoa menggunakan CASA dan kaitannya dengan fertlitas, 3) menguji penggunaan perangkat mikrofluida berbasis benang dalam menganalisis kualitas semen pada parameter viabilitas spermatozoa, dan 4) mempelajari ekspresi gen PRM1 dan imunolkalisasi protein PRM1 spermatozoa pada sapi bali dengan tingkat fertilitas berbeda. Penelitian pertama dilakukan dengan mengelompokkan sapi bali yang dibagi menjadi kelompok fertilitas suprior dan baik (SF dan GF) berdasarkan nilai conception rate (%CR). Semen beku dikoleksi dan dievaluasi secara mikroskopis, meliputi motilitas, viabilitas, keutuhan membran plasma (MPU), abnormalitas, dan fragmentasi DNA spermatozoa. Perbedaan kualitas semen pada masing-masing kelompok dianalisis menggunakan independent-sample t-test. Rerata %CR kelompok SF dan GF masing-masing adalah 89,43±0,19% dan 81,03±0,75%. Motilitas, viabilitas, MPU, abnormalitas, dan fragmentasi DNA spermatozoa pada kelompok SF dan GF adalah 59,32±2,09% vs 51,90±1,64% (P<0,05), 66,57±0,95% vs 65,64±1,20% (P>0,05), 69,20 ±2,76 vs 64,18±2,50% (P>0,05), 1,92±0,15% vs 2,32±0,13% (P<0,05), dan 2,17±0,29% vs 3,03±0,23% (P<0,05). Perbedaan signifikan antara karakteristik kualitas semen beku sapi antara kelompok SF dan GF ditemukan pada parameter motilitas progresif, abnormalitas dan fragmentasi DNA spermatozoa. Namun, seluruh parameter memiliki korelasi kuat dengan tingkat fertilitas, yang mana parameter motilitas, viabilitas dan keutuhan membran plasma spermatozoa berkorelasi positif, sedangkn abnormalitas dan fragmentasi DNA spermatozoa memiliki korelasi negatif dengan tingkat fertilitas sapi bali. Karakteristik semen sapi bali dengan demikian, dapat dijadikan sebagai indikator awal dalam memprediksi fertilitas pejantan. Penelitian kedua dilakukan dengan mengevaluasi semen berdasarkan parameter kinematika motilitas spermatozoa (progressive motility/PM, curvilinear velocity/VCL, average path/VAP, straight line velocity/VSL, the amplitude of the lateral head displacement/ALH, dan beat-cross frequency/BCF) dan morfologi abnormal (proximal droplet, distal droplet, bent tail, dan coiled tail) spermatozoa dengan menggunakan CASA. Perbedaan nilai kinematika dan morfologi spermatozoa antar kelompok fertilitas diuji menggunakan independent sample t-tes. Hasil penelitian menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara grup SF dan GF (P<0,05) pada parameter PM, VAP, VCL, VSL, ALH, dan BCF. Parameter morfologi spermatozoa juga menunjukkan adanya perbedaan yang nyata pada proximal droplet (P<0,05) dan distal droplet (P<0,05) antara grup SF dan GF tetapi tidak ada perbedaan pada bent tail (P>0,05), and coiled tail (P>0,05). Kesimpulannya, parameter kinematik (VCL, VSL, VAP, ALH, dan BCF) dan morfologi (proximal droplet dan distal droplet) spermatozoa berbasis CASA dapat digunakan untuk memprediksi fertilitas pejantan. Penelitian ketiga dilakukan dengan membuat desain perangkat mikrofluida berbasis benang katun. Benang katun dicuci menggunakan larutan Na2CO3 dengan konsentrasi 10 mg/mL selama 5 menit pada suhu 100 °C, dibilas dengan aquabidest dan dikeringkan. Benang kemudian diberi uji pendahuluan yang meliputi panjang rembesan, daya tampung fluida, dan kecepatan rembesan fluida pada benang. Pengujian viabilitas spermatozoa pada perangkat mikrofluida menggunakan sampel semen beku post-thawing dari 6 pejantan sapi bali dengan ulangan 3 batch produksi dilakukan bersamaan dengan pengamatan viabilitas spermatozoa metode konvensional di laboratorium. Pengamatan dilakukan setiap 1 jam hingga seluruh spermatozoa mati (viabilitas spermatozoa 0%). Sebanyak 1 μL larutan eosin-nigrosin diteteskan pada benang bagian inlet, dikering-udarakan selama 24 jam, diteteskan 2 μL sampel semen pada bagian benang yang sama dan dibilas menggunakan larutan NaCl fisiologis. Persistensi warna yang terbentuk kemudian diamati. Seluruh proses pengujian direkam menggunakan kamera ponsel dengan resolusi 13 MP dan diamati pada detik ke-0, 15, 30, 45, dan 45. Persentase viabilitas spermatozoa hasil pengamatan metode konvensional di laboratorium dijadikan dasar dalam menentukan kelompok intensitas persistensi warna benang. Intensitas persistensi warna yang terbentuk diukur menggunakan aplikasi ImageJ. Data panjang rembesan, daya tampung dan kecepatan rembesan dianalisis secara deskriptif dan data intensitas warna dianalisis menggunakan RAL. Panjang rembesan pada benang dengan volume reagen 1, 2, dan 3 µL berturut-turut adalah 0,89±0,11; 1,30±0,21; dan 1,63±0,13 cm. Daya tampung benang katun dengan panjang 5 cm memiliki daya tampung maksimal sebesar 30 µL dalam waktu 16 detik. Intensitas persistensi warna benang berbeda nyata pada persentase viabilitas spermatozoa 0, 13,99; 32,66; 46,5; dan 61,84% (P<0,05) dan waktu pengamatan 30 detik (P<0,05). Intensitas persistensi warna benang terjelas adalah pada waktu pengamatan 30 detik dengan R2 = 0,9901. LoD and LoQ pada perangkat mikrofluida ini adalah 0,295 mg/L dan 0,985 mg/L. Perangkat mikrofluida berbasis benang katun potensial digunakan sebagai kit analisis cepat untuk viabilitas spermatozoa. Penelitian keempat dilakukan dengan menganalisis ekspresi PRM1 dan imunolkaslisasi protein PRM1 spermatozoa. Ekspresi PRM1 dikuantifikasi dengan metode qRT-PCR. Analisis immunocytochemistry (ICC) dilakukan untuk mengidentifikasi imunolokalisasi protein PRM1 spermatozoa. Perbedaan ekspresi PRM1 dan imunolokalisasi protein PRM1 pada masing-masing kelompok dianalisis menggunakan independent-sample t-test. Rerata %CR kelompok SF dan GF masing-masing adalah 89,43±0,19% dan 81,03±0,75%. Ekspresi gen dan imunolokalisasi protein PRM1 berturut-turut adalah 7,17±0,67 vs 3,20±0,38 (P<0,05) dan 62,96±2,06% vs 48,67±3,57% (P<0,05) pada kelompok SF dan GF. Penelitian ini menyimpulkan bahwa ekspresi gen dan imunolokalisasi protein PRM1 terdeteksi signifikan lebih tinggi pada kelompok SF. Gen dan protein PRM1 spermatozoa dengan demikian berpotensi dapat digunakan sebagai penanda fertilitas pejantan bali.