Kajian Proteomik dan Fenotipe Pejantan Ayam Kampung Unggul Balitbangtan (KUB) Terhadap Kualitas Semen Segar dan Semen Beku

Abstract

Fenotip adalah karakteristik (struktural, biokimiawi, fisiologis, dan perilaku) yang dapat diamati dari suatu organisme yang diatur oleh genotipe dan lingkungan serta interaksi keduanya. Fenotip pada ayam seperti jengger dan warna bulu telah dilaporkan dapat menggambarkan kualitas semen. Fenotip ini diduga berhubungan dengan konsentrasi hormon testosteron yang berhubungan juga dengan spermatogenesis. Kualitas semen berhubungan dengan kandungan protein pada plasma semen maupun sperma. Analisis protein pada semen dapat dilakukan menggunakan liquid chromatography tandem mass spectrophotometry (LC-MS/MS). Alat tersebut dapat mengidentifikasi protein berdasarkan sifat kimia dan rasio massa/muatan (m/z) protein. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi semen segar dan hubungannya dengan konsentrasi testosteron, kualitas semen beku, dan kandungan protein semen (plasma semen dan sperma) pada ayam KUB dengan fenotip berbeda. Penelitian ini terdiri atas 1) Karakterisasi kualitas semen ayam KUB berdasarkan perbedaan fenotip dan korelasinya dengan testosteron, 2) Analisis kualitas semen beku ayam KUB berdasarkan perbedaan fenotip, 3) Identifikasi profil protein semen ayam KUB dan fungsinya berdasarkan perbedaan tipe jengger menggunakan SDS-Page dan LC-MS/MS. Sampel semen dan plasma darah yang digunakan pada tahap satu dan dua berasal dari empat kelompok ayam yaitu jengger tunggal bulu penutup merah (JTBM), jenggger tunggal bulu penutup putih (JTBP), jengger pea bulu penutup merah (JPBM), dan jengger pea bulu penutup putih (JPBP). Sampel semen yang digunakan pada tahap tiga dibedakan berdasarkan tipe jengger. Penelitian tahap pertama adalah karakterisasi kualitas semen ayam KUB berdasarkan perbedaan fenotip dan korelasinya dengan testosteron. Hasil penelitian menunjukkan pejantan dengan fenotip JPBM memiliki volume semen paling tinggi dan JTBM adalah yang paling rendah (P<0,05). Pejantan JTBM juga memiliki motilitas dan konsentrasi sperma paling rendah dibandingkan dengan fenotip lainnya.. Diameter taji tidak berbeda nyata pada setiap kelompok (P>0,05), sedangkan panjang taji pada kelompok jengger pea lebih tinggi dari kelompok JTBP (P<0,05), tetapi tidak berbeda nyata dengan kelompok JTBM. Konsentrasi sperma dan testosteron pada kelompok JPBM tidak berbeda dengan kelompok JPBP dan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok JTBP (P<0.05). Diameter dan panjang taji berkorelasi positif dengan konsentrasi testosteron dengan nilai “r” masing-masing 0,57 dan 0,41. Kesimpulan tahap I bahwa kelompok JPBM memiliki kualitas semen paling baik. Penelitian tahap kedua yaitu pembekuan semen menggunakan pengencer ringer laktat kuning telur (RLKT), ringer laktat kuning telur+fruktosa (RLKTF), dan ringer laktat kuning telur+glukosa (RLKTG) yang berasal dari kelompok JTBM, JTBP, JPBM, dan JPBP. Motilitas dan viabilitas sperma post-thawing ayam KUB paling tinggi ditunjukkan pengencer RLKTG (P<0,05). Abnormalitas sperma post-thawing JTBM dalam pengencer RLKTG paling rendah dibandingkan dengan kelompok lainnya. Kesimpulannya kelompok JTBM menunjukkan hasil PTM yang paling baik. Pengencer terbaik dalam mempertahankan kualitas semen post-thawing adalah RLKTG. Penelitian tahap ketiga menggunakan semen (plasma semen dan sperma) dari kelompok jengger tunggal dan jengger pea. Kelompok penelitian menjadi plasma semen jengger tunggal (PSJT), plasma semen jengger pea (PSJP), sperma jengger tunggal (SJT), dan sperma jengger pea (SJP). Sampel dianalisis menggunakan SDS-Page dengan pewarnaan Comassie Brilliant Blue yang dilanjutkan dengan analisis LC-MS/MS. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 10 pita protein yang terbentuk pada kelompok PSJT dan PSJP dengan berat molekul ~5-10 kDa, sampai 101-140 kDa dan dua pita yang tidak terbentuk pada kelompok SJT dan SJP dengan berat molekul ~5-10 kDa dan 21-25 kDa. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat 171 jenis protein pada kelompok PSJT, dan yang hanya diekspresikan pada kelompok PSJT terdiri atas 75 jenis protein. Kelompok PSJP mengekspresikan 144 protein pada kelompok PSJP, dan yang hanya terekspresikan pada kelompok ini terdiri atas 48 protein. Kelompok SJT mengekspresikan total protein 153 jenis dan yang spesifik terdiri atas 77 jenis protein. Total protein yang terdapat pada kelompok SJP adalah 99 jenis sedangkan yang diekspresikan secara spesifik terdiri atas 23 protein. Protein yang hanya terekspresi dalam kelompok SJT dan terlibat dalam fertilisasi adalah protein PLCZ1 dengan mengaktivasi oosit melalui Ca2+ signaling. PGAM1 merupakan protein yang hanya diekpresikan di PSJT dan SJT dan berperan dalam glikolisis. Protein Kinase M2 tidak terekspresi pada kelompok PSJP dan SJP yang berperan dalam proliferasi sel dan menjadi kandidat utama dalam pembentukkan jengger. Kelompok SJT mengeskpresikan protein yang beperan dalam fosforilasi oxidatif yaitu SDHA, COX5A dan COX4I1. Protein PARK7 hanya terdapat pada SJT yang memiliki peran penting dalam fertilisasi, metabolisme dan aktivasi antioksidan. Hasil penelitian ini menunjukkan fenotip berpengaruh pada kualitas semen ayam KUB. Kelompok JPBM menunjukkan kualitas semen segar yang baik. Kualitas semen beku pada kelompok JTBM lebih baik jika dibandingkan dengan ketiga kelompok lainnya. Pengencer RLKTG lebih baik dalam mempertahankan kualitas semen ayam KUB post-thawing. Viabilitas dan Abnormalitas post-thawing yang baik pada kelompok JTBM dan JTBP yang dipengaruhi oleh protein PARK7 dan PRDX yang berperan sebagai antioksidan dan hanya diekspresikan pada kelompok SJT. Protein ini merupakan penanda freezability pada sperma karena mampu mencegah kerusakan sperma akibat pembekuan. Protein spesifik yang berperan penting pada penelitian ini dan hanya diekspresikan sperma jengger tunggal adalah SDHA, COX5A, COX4I1, PARK7, PLCZ1, PRDX1 dan PRDX3 sebagai penanda fertilitas. Kesimpulan dari penelitian ini adalah kelompok JTBM lebih baik untuk dijadikan pejantan unggul karena menunjukkan motilitas semen segar >75% dan kualitas (post-thawing motility) PTM yang baik serta mengekspresikan protein penanda fertilitas maupun freezability.

Phenotype is the observable characteristics (structural, biochemical, physiological, and behavioral) of an organism that are determined by genotype and environment and the interaction between these two factors. Phenotypes in chickens, that are also secondary sexual organs, such as comb and plumage color, have been reported to be able to predict semen quality. This phenotype is related to the concentration of the hormone testosterone, which is also related to spermatogenesis. Semen quality is related to the protein content in semen plasma and sperm. It is known that protein in semen plays a role in metabolic processes, antioxidants and in the formation of sperm morphology. Protein analysis in semen can be performed using liquid chromatography tandem mass spectrophotometry (LC-MS/MS). With this instrument, proteins can be identified by their chemical properties and mass/charge ratio (m/z) of proteins. This study aims to investigate fresh semen and its relationship with testosterone concentration, frozen semen quality, and semen protein content (plasma semen and sperm) in KUB chickens with different phenotypes. This study included 1) characterization of KUB chicken semen quality based on phenotypic differences and its correlation with testosterone, 2) analysis of KUB chicken frozen semen quality based on phenotypic differences, 3) identification of KUB chicken semen protein profile based on differences in comb types using SDS-Page and LC-MS/MS. The semen and blood plasma samples used used in the first two stages were from four groups of chickens, namely single comb and black or dark brown feather colour with red feather neck colour (SCNR), green-black feather colour with white feather neck colour (SCNW), Pea comb and black or dark brown feather colour with red feather neck colour (PCNR), and pea comb and green-black feather colour with white feather neck colour (PCNW). The semen samples used in the third stage are differentiated according to the type of comb. The first phase of the study was to characterize the semen quality of KUB chickens based on phenotypic differences and their correlation with testosterone. The results of the analysis showed that males with the PCNR phenotype had the highest semen volume and the lowest found in SCNR (P<0.05). The lowest sperm concentration was found in the SCNW phenotype and the highest in the PCNW phenotype group (P<0.05). The PCNW phenotype had the highest and lowest testosterone concentrations in the SCNW phenotype but there was no difference between the SCNR and SCNW groups. The spur diameter did not differ between phenotypic groups (P>0.05), the PCNW group had longer spurs than the SCNW group and did not differ from the SCNR and PCNR groups. The spur diameter and length correlated positively with testosterone concentration with “r” values of 0.57 and 0.41, respectively. The conclusion of of the first phase was that the PCNW group had better semen quality than the other groups. In the second phase of the study, sperm were frozen using egg yolk lactate (RLEY), egg yolk lactate + fructose (RLEYF), and egg yolk + glucose (RLEYG) diluents from the SCNR, SCNW, PCNR, and PCNW groups. The results showed that there was no interaction between diluent and chicken phenotype on sperm motility and viability. The abnormality of SCNR sperm after thawing was lowest in compared to the other groups. The highest sperm motility and viability of KUB chickens after-thawing was observed in the RLEYG diluent (P<0.05). In conclusion, the SCNR group showed the best PTM results. The best diluent for maintaining the quality of semen after thawing is RLEYG. The third phase the semen (seminal plasma and sperm) of the single comb and pea comb groups were used. The research group consisted of single comb plasma semen (SCPS), pea comb plasma semen (PCPS), single comb sperm (SCS), and pea comb sperm (PCS). Samples were analyzed using SDS-Page with Comassie Brilliant Blue staining followed by LC-MS/MS analysis. The results of this study indicated that in the SCPS and PCPS groups there are 10 protein bands formed with a molecular weight of ~5-10 kDa, up to 101-140 kDa and two bands that are not formed in the SCS and PCS groups with a molecular weight of ~5-10 kDa and 21-25 kDa. The results of this study show that 75 protein types are present in the SCPS group, 48 proteins in the PCPS group, 77 proteins in the SCS and 23 proteins in the PCS group. The protein expressed in each group and involved in fertilization is the PLCZ1 protein which activates oocytes through Ca2+ signaling. PGAM1 is a protein expressed only in SCPS and SCS and plays a role in glycolysis. Protein Kinase M2 was not expressed in the PCPS and PCS groups which played a role in cell proliferation and became the main candidate for comb formation. The SCS group expressed proteins that play a role in oxidative phosphorylation, namely SDHA, COX5A and COX4I1. The protein PARK7 protein plays an important role in fertilization, metabolism and antioxidants activation found only in SCS. The results of this study indicated that phenotype has an influence on the semen quality of KUB chickens. The PCNR group had good fresh semen quality. The frozen semen quality of the SCNR group was better compared to the other three groups. KUB chickens with pea comb phenotype with red covering feathers showed good fresh semen quality. Spur length is a more accurate indicator of testosterone concentration in KUB chickens. Frozen semen quality of the SCNR group was better compared to the other three groups. The RLEYG diluent is more suitable to maintain the semen quality of KUB chickens after thawing. Each group of chickens expressed different semen protein, which was directly related to the fresh semen quality and sperm sperm viability after freezing. Good sperm viability after thawing and abnormalities in the SCNR and SCNW groups. This is influenced by the proteins PARK7 and PRDX, which act as antioxidants and are expressed only in the SCS group. Specific proteins that play an important role in this study and are expressed only by single cockscomb sperm are SDHA, COX5A, COX4I1, PARK7, PLCZ1, PRDX1 and PRDX3 as fertility markers. The conclusion of this study is that the SCNR group is better because it has fresh sperm motility >75%, good good after thawing quality and expresses fertility and freezability marker proteins.