Identifikasi Senyawa Biomarker Stress Protectant Melalui Metabolomik dan Aplikasinya pada Fermentasi Bioetanol Suhu Tinggi oleh Pichia kudriavzevii 1P4

Abstract

Bioetanol adalah salah satu sumber alternatif unggul dalam mengatasi krisis energi penggunaan bahan bakar berbasis fosil. Proses fermentasi dalam memproduksi bioetanol dilakukan dengan bantuan mikroba fermentatif khamir. Selama proses fermentasi berlangsung, sel khamir dihadapkan pada banyak cekaman yang terjadi seperti cekaman suhu tinggi karena adanya proses akibat reaksi eksotermis, sehingga menaikkan suhu fermentasi. Peningkatan suhu selama reaksi fermentasi tersebut dapat menyebabkan kerusakan membran dan protein yang berpengaruh pada menurunnya produksi etanol. Khamir P. kudriavzevii 1P4 merupakan termotoleran yang menjadi salah strategi untuk teknologi bioproses sistem suhu tinggi. Selain itu, khamir ini kriteria utama untuk produksi etanol yang efisien untuk negara-negara tropis yang umumnya memiliki rata-rata suhu yang tinggi pada siang hari di sepanjang tahun. Namun, hingga saat ini belum diketahui metabolit intraseluler pada isolat P. kudriavzevii 1P4 selama fermentasi etanol pada sistem suhu tinggi. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi metabolit biomarker sebagai stress protectant yang terdapat pada isolat P. kudriavzevii 1P4 dalam menghadapi fermentasi suhu tinggi melalui analisis metabolomik, serta optimalisasi produksi bioetanol berbasis fermentasi suhu tinggi (42 ˚C dan 45 ˚C) melalui suplementasi senyawa biomarker. Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu peremajaan dan karakterisasi morfologi isolat P. kudriavzevii 1P4, uji ketahanan isolat P. kudriavzevii 1P4 terhadap cekaman suhu (30 ˚C, 37 ˚C, 42 ˚C, dan 45 ˚C) dengan metode spot assay, pengukuran konsumsi glukosa isolat P. kudriavzevii 1P4 menggunakan metode DNS, produksi bioetanol diukur menggunakan kromatografi gas (GC), quenching dan ekstraksi metabolit intraseluler isolat P. kudriavzevii 1P4, Analisis profil metabolit menggunakan kromatografi cair spektrometri massa/spektrometri massa (LC-MS/MS), identifikasi metabolit secara putatif dengan LC-MS/MS, analisis multivariat menggunakan orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) dan nilai variable importance of projection (VIP) untuk menentukan senyawa biomarker stress protectant isolat P. kudriavzevii 1P4. Selanjutnya dilakukan uji ketahanan dan produksi bioetanol isolat P. kudriavzevii 1P4 terhadap cekaman suhu tinggi (42 ˚C dan 45 ˚C) dengan penambahan senyawa biomarker dengan konsentrasi 1 mM. Isolat P. Kudriavzevii 1P4 yang ditumbuhkan pada media agar YPD secara morfologi menunjukkan koloni yang tumbuh berwarna putih kekuningan, berbentuk bulat, tekstur koloni kental, berbutir, permukaan yang halus dan kusam. Secara mikroskopis, karakter morfologi isolat P. kudriavzevii 1P4 berbentuk ellipsoid (oval) memanjang dengan ukuran berkisar 3-10 µm dengan pertunasan monopolar dan tidak memiliki pseudohifa. Berdasarkan spot assay, isolat P. kudriavzevii 1P4 menunjukkan ketahanan terhadap cekaman fermentasi suhu yang lebih baik dibandingkan isolat kontrol S. cerevisiae BY4741 ditandai isolat P. kudriavzevii 1P4 mampu tumbuh pada media cekaman hingga suhu 45 ˚C, sedangkan isolat S. cerevisiae BY4741 hanya mampu bertahan dengan suhu maksimal 37 ˚C. Konsumsi glukosa pada suhu 42 ˚C (18,76 g/l) dan suhu 45 ˚C (18,38 g/l) lebih tinggi dibandingkan pada suhu 30 ˚C (14,06 g/l) dan 37 ˚C (16,44 g/l). Isolat P. kudriavzevii 1P4 menghasilkan konsentrasi etanol, yield etanol (Yp/s), produktivitas etanol (Qp) dan efisiensi fermentasi (Ey) tertinggi pada kondisi fermentasi dengan suhu 37 ˚C yang merupakan kondisi optimum isolat P. kudriavzevii 1P4. Analisis multivariat OPLSDA berhasil mengelompokkan isolat P. kudriavzevii 1P4 berdasarkan perlakuan suhu menggunakan kromatogram keseluruhan. Berdasarkan nilai VIP yaitu senyawa L-prolin (v2) yang diduga sebagai senyawa biomarker stress protectant dalam fermentasi etanol pada suhu tinggi (>40 ˚C). Isolat P. kudriavzevii 1P4 yang ditumbuhkan dengan penambahan L-prolin menunjukkan ketahanan terhadap cekaman fermentasi suhu yang lebih baik jika dibandingkan isolat kontrol negatif yang tidak ada penambahan senyawa biomarker stress protectant dan kontrol positif dengan penambahan senyawa trehalosa pada masing-masing suhu 42 ˚C dan 45 ˚C. Isolat P. kudriavzevii 1P4 dengan penambahan senyawa L-prolin menunjukkan peningkatan produktivitas etanol sebesar 36,36% dibandingkan dengan perlakuan tanpa penambahan senyawa biomarker stress protectant dan perlakuan dengan penambahan senyawa trehalosa, namun memiliki nilai produksi yang sama dengan suhu optimum (37 ˚C) isolat P. kudriavzevii 1P4 yaitu 0,15±0,01 g/l/h. Selain itu, pada suhu 45 ˚C dengan penambahan senyawa L-prolin, produktivitas etanol meningkat sebesar 83,33% dibandingkan dengan perlakuan tanpa penambahan senyawa L-prolin dan 37,5% dengan penambahan senyawa trehalosa. Hasil ini mengindikasikan bahwa suplementasi berupa senyawa stress protectant (L-prolin) dapat meningkatkan produksi bioetanol berbasis fermentasi suhu tinggi (42 ˚C dan 45 ˚C) dan menjadi landasan dalam pengembangan teknologi rekayasa bioproses.