Pemanfaatan Data Long Read Sequences untuk Analisis Genetik Lanjut pada Dipterocarpus littoralis dan Shorea javanica

Abstract

Banyak tumbuhan asli Indonesia yang termasuk spesies dengan status konservasi terancam dan sangat terancam punah/kritis seperti S. javanica yang berstatus endangered (EN) dan D. littoralis yang berstatus critically endangered (CR) berdasarkan IUCN Red List 2018. Upaya konservasi sumber daya genetik spesies tersebut memerlukan data dan informasi genetik dan genomik yang umumnya masih belum tersedia. Saat ini dengan adanya teknologi sekuensing generasi ketiga, khususnya teknologi long read sequence dari Oxford Nanopore, maka analisis genetik dapat dilakukan dengan lebih mudah dan terjangkau. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan analisis genetik tingkat lanjut yang hasilnya berupa draf genom kloroplas parsial dan klaster gen biosintesis pada D. littoralis dan S. javanica. Prosedur penelitian meliputi ekstraksi dan isolasi DNA dengan modifikasi dari metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide), sekuensing menggunakan MinION dengan tipe pore flow cell R9.4 dan analisis DNA secara bioinformatika yang tahapannya meliputi basecalling, QC, assembly dan annotation. Untuk analisis lanjut DNA dilakukan dua kali annotation, yaitu untuk mengamati gen kloroplas dengan menggunakan CHLOROBOX di Geseq dan untuk mengamati biosynthetic gene cluster menggunakan BRAKER2 dan PlantiSMASH. Ukuran D. littoralis dan S. javanica yang berhasil dibaca sebesar 40.219.030 read dan 498.044 read dengan rata – rata panjang dan N50 masing – masing sebesar 1.204,4 bp & 1.816 bp dan 2.402,1 bp & 5.239 bp. Kemudian, rakitan seluruh read menghasilkan 8.399 contig dari DNA D. littoralis dan 4.409 contig dari DNA S. javanica dengan total panjang bacaan masing – masing sebesar 349,7 Mbp dan 105,7 Mbp. Berdasarkan data DNA tersebut, ditemukannya informasi genetik berupa beberapa gen dalam draf genom kloroplas dari D. littoralis sebanyak 5 gen yang utuh (rps7, rpl32, psbM, petA, petL) dan S. javanica sebanyak 8 gen yang utuh (ndhD, ndhG, ndhI, psbJ, psbL, psbF, psbE, rbcL) yang terlibat sintesis ribosom, fotosintesis dan gen lainnya. Kemudian, pada analisis klaster gen biosintesis ditemukan terdapat 77 klaster pada D. littoralis yang terdiri dari 44 klaster terpena, 4 klaster sakarida, 1 klaster lignan, 6 klaster alkaloid, 1 klaster sakarida-terpena yang diduga saponin terpenoid, dan 1 klaster sakarida-poliketida yang diduga glikosida antrakuinon serta terdapat 20 klaster lainnya yang masih termasuk putative cluster. Sedangkan, pada S. javanica hanya ditemukan 12 klaster yang terdiri dari 11 klaster terpena dan 1 klaster sakarida.

Many native plants of Indonesia included species that is threatened in conservation status, such as S. javanica which is endangered (EN), and D. littoralis which is critically endangered (CR) based on the IUCN Red List 2018. Efforts to conserve the genetic resources of these species require genetic and genomic data and information, which are generally still unavailable. Currently, sequencing with the third generation of technology, particularly the long-read sequence technology from Oxford Nanopore, has made genetic and genomic analysis easier and more affordable. The objective of this study was to carry out an advanced genetic analysis, particularly on drafting a partial chloroplast genome and analyzing a biosynthetic gene cluster in D. littoralis and S. javanica. The research procedures included extraction and isolation of DNA with modifications of the CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) method, sequencing using MinION with pore flow cell R9.4 type, and bioinformatics DNA analysis whose stages included base calling, quality check, assembly, and annotation. DNA analysis to observe the chloroplast gene was carried out using CHLOROBOX in Geseq, while analysing the biosynthetic gene cluster was done using BRAKER2 and PlantiSMASH. The sequencing of DNA of D. littoralis and S. javanica resulted in 40,219,030 reads and 498,044 reads, respectively with N50 average lengths of 1,204.4 bp & 1,816 bp and 2,402.1 bp & 5,239 bp, respectively. The entire read assembly resulted in 8,399 contigs of D. littoralis DNA and 4,409 contigs of S. javanica with a total read length of 349.7 Mbp and 105.7 Mbp, respectively. Based on the DNA data, genetic information was found in the form of several genes in the chloroplast genome draft of D. littoralis as many as five intact genes (rps7, rpl32, psbM, petA, petL) and eight intact S. javanica genes (ndhD, ndhG, ndhI, psbJ, psbL, psbF, psbE, rbcL) involved in ribosome synthesis, photosynthesis, and other genes. Then, in the analysis of the biosynthetic gene clusters, it was found that there were 77 clusters in D. littoralis consisting of 44 terpene clusters, four saccharide clusters, one lignan cluster, six alkaloid clusters, one saccharide-terpene cluster suspected to be terpenoid saponins, and one saccharide-polyketide cluster. which is suspected to be anthraquinone glycosides and 20 other clusters are still included in the putative genes. Meanwhile, only 12 clusters were found in S. javanica consisting of 11 terpene clusters and one saccharide cluster.