Ekspresi, Purifikasi, dan Karakterisasi Protease dari Lactobacillus plantarum IIA-1A5 dan Aktivitasnya pada Protein Produk Hasil Ternak

Abstract

Lactobacillus plantarum IIA-1A5 adalah isolat lokal yang diisolasi dari daging sapi Peranakan Ongole yang ada di Bogor. Bakteri ini memiliki beberapa keunggulan, antara lain mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli. Staphylococcus aureus, dan Salmonella typhimurium; memiliki toleransi terhadap pH yang rendah; sebagai bahan preservasi alami dan mempunyai sifat proteolitik. Anotasi genom L. plantarum IIA-1A5 menunjukkan adanya gen penyandi protease menyerupai Lon (Lon-Like) yang berpotensi untuk aplikasi lebih lanjut. Protease merupakan enzim yang sangat penting dan paling banyak diaplikasikan pada bidang sains, fisiologis (pengobatan), dan industri pangan maupun non-pangan. Sampai saat ini Indonesia masih mengimpor enzim protease dan setiap tahun terjadi peningkatan impor. Sebaliknya, Indonesia adalah negara yang sangat kaya akan biodiversitas hayati yang sangat memungkinkan untuk mengeksplorasi sumber-sumber protease lokal untuk memenuhi kebutuhan dalam negeri yang terus meningkat. Penelitian ini dilakukan dalam 3 (tiga) tahap. Tahap 1 bertujuan untuk melakukan optimasi, sintesis, dan kloning gen Lon-Like IIA-1A5 in silico; memprediksi struktur tiga dimensi dan menganalisis sisi aktif enzim. Optimasi, sintesis, dan kloning gen Lon-Like IIA-1A5 dilakukan secara in silico dengan sistem OptimumTM dari GenScript (New Jersey, USA). Analisis struktur tiga dimensi protease Lon-Like IIA-1A5 menggunakan server SWISS-MODEL dan analisis sisi aktif menggunakan aplikasi CLUSTAL OMEGA. Tujuan penelitian tahap ke 2 (dua) adalah mempelajari dan mengevaluasi ekspresi protease Lon-Like IIA-1A5, aktivitas proteolitik, dan overproduksi. Proses transformasi dilakukan dengan metode heat shock. Plasmid pET-28a (+) yang telah disisipi gen Lon-Like IIA-1A5 diekspresikan dalam vektor ekspresi yaitu E. coli BL21 (DE3). Validasi keberhasilan transformasi dilakukan dengan menumbuhkan E. coli BL21 (DE3) pada media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin. Penelitian tahap 3 bertujuan untuk melakukan purifikasi Lon-Like IIA-1A5 dan mempelajari aktivitasnya pada protein produk hasil ternak. Purifikasi kromatografi afinitas dilakukan dengan menggunakan column HisTrapTM FF dan bufer elusi dengan komposisi Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM dan imidazole (10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 dan 500 mM). Hasil penelitian tahap 1 menunjukkan Lon-Like-IIA-1A5 mempunyai 1080 pasang basa yang membangun 360 asam amino. Ada 19 asam amino kecuali sistein yang menyusun Lon-Like IIA-1A5. Optimasi gen meningkatkan nilai CAI (codon adaptation index) Lon-Like-IIA-1A5 dari 0,43 menjadi 0,97 dan nisbah GC meningkat dari 48,34% menjadi 56,57%. Analisis gel agarose menunjukkan gen penyandi protease Lon-Like IIA-1A5 berhasil disisipkan ke dalam vektor plasmid pET-28a (+). Dari analisis SWISS-MODEL diperoleh struktur tiga dimensi (3D) Lon-Like IIA-1A5 adalah berbentuk monomer yang terdiri atas 6 α-heliks 8 β-sheet dan 15 loop. Analisis situs aktif dilakukan dengan server CLUSTAL OMEGA dan diperoleh hasil bahwa Lon-Like IIA-1A5 mempunyai dua residu asam amino pada