Imunoprofilaksis dan Imunoterapi Berbasis Imunoglobulin Y (IgY) Telur Ayam terhadap Infeksi Streptokokal pada Ikan Nila Merah (Oreochromis hybrid)

Abstract

Perikanan merupakan salah satu sektor unggulan bagi negara Indonesia. Salah satu komoditas perikanan yang masuk ke dalam sepuluh besar komoditas budidaya prioritas di Indonesia adalah ikan nila. Adanya penyakit dapat menjadi ancaman serius di suatu lingkungan budidaya perikanan apabila tidak dicegah maupun diobati keberadaannya. Infeksi bakteri streptokokal merupakan penyakit infeksius kausa bakteri pada akuakultur yang banyak menyerang komoditas ikan nila dan beberapa jenis ikan lainnya di dunia. Antibiotik tidak jarang menjadi pilihan dalam pengobatan penyakit bakterial yang memicu resistansi secara global. Alternatif penggunaan antibiotik yang dapat dikembangkan sebagai upaya pencegahan dan pengobatan penyakit bakterial adalah menggunakan imunoglobulin Y (IgY) asal kuning telur ayam. Tujuan umum penelitian adalah mengeksplorasi dan mengevaluasi potensi IgY anti-infeksi streptokokal sebagai basis imunoprofilaksis dan imunoterapi pada ikan nila merah (Oreochromis hybrid). Terdapat tiga rangkaian studi yang dilakukan untuk mencapai tujuan tersebut.

Studi pertama adalah sifat biologis IgY terhadap berbagai pH air, salinitas air, suhu, serta keberadaan enzim protease. Studi bertujuan untuk mengeksplorasi sifat biologis IgY anti-infeksi streptokokal terhadap pengaruh lingkungan perairan, seperti pH dan salinitas; suhu; dan keberadaan enzim protease yang disimulasikan mengikuti pH dan konsentrasi optimal pada saluran pencernaan ikan nila. Metode yang digunakan berupa karakterisasi molekul protein IgY dengan metode Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) untuk mengevaluasi kualitas molekul pascainkubasi pada berbagai perlakuan dan metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tidak langsung untuk mengevaluasi secara kuantitatif terhadap molekul IgY. Hasil menunjukkan bahwa salinitas air (0, 15, dan 30 ppt) dan kondisi pH air (6,5, 7,5, dan 8,5) dengan masa inkubasi selama enam hari, serta suhu inkubasi pada 25, 45, dan 60 °C selama 60 menit tidak memengaruhi terhadap bobot molekul dan terkonfirmasi positif masih dapat terdeteksi pada ELISA. Kondisi ekstrim pada suhu 80 °C menunjukkan hasil negatif pada pengujian ELISA mulai menit ke-40 masa inkubasi, namun secara kualitatif masih dapat terdeteksi dengan baik dan tidak menunjukkan adanya perubahan bobot molekul pada gel SDS PAGE. Inkubasi pada enzim tripsin selama 60 menit tidak menunjukkan pengaruh terhadap karakteristik bobot molekul dari IgY serta konfirmasi ELISA masih menunjukkan hasil positif. Akan tetapi, inkubasi pada enzim pepsin selama 60 menit menyebabkan molekul IgY hilang dan tidak dapat terdeteksi pada gel SDS PAGE maupun pada uji ELISA mulai menit ke-40 masa inkubasi.

Studi kedua adalah fungsi biologis molekul IgY sebagai aglutinin, inhibin, dan potensinya sebagai bakterisidal melalui aktivasi komplemen. Tujuan studi dilakukan untuk mengobservasi fungsi biologis IgY dalam melawan Enterococcus faecalis sebagai salah satu penyebab infeksi streptokokal. Metode yang digunakan dalam uji fungsi aglutinin dilakukan dengan mengobservasi pertumbuhan E. faecalis pada media kaldu brain-heart infusion (BHI) yang ditambahkan dengan suspensi IgY. Fungsi inhibin dilakukan dengan metode spektrofotometri untuk mengukur tingkat kekeruhan suspensi bakteri yang diinokulasi dengan penambahan suspensi IgY. Potensi bakterisidal melalui jalur aktivasi komplemen terhadap serum ikan nila merah dilakukan dengan metode scanning electron microscope (SEM) untuk mengevaluasi morfologi dinding sel bakteri. Evaluasi in silico juga dilakukan untuk mengetahui karakteristik protein fragment of complement (Fc) imunoglobulin Y (IgY) ayam dan reseptor komplemen C1 ikan nila. Hasil studi menunjukkan bahwa IgY berpotensi sebagai substansi aglutinin, inhibin, dan sebagai bakterisidal melalui potensinya dalam dugaan aktivasi komplemen pada komoditas ikan nila merah. Adapun karakteristik dari kedua protein bersifat stabil dan memiliki kecenderungan untuk mudah larut dalam pelarut air.

Studi ketiga adalah uji efikasi in vivo pelet yang mengandung IgY anti-infeksi streptokokal sebagai imunoprofilaksis dan imunoterapi pada ikan nila merah (Oreochromis hybrid). Studi bertujuan untuk menguji efikasi pelet yang mengandung IgY anti-infeksi bakteri streptokokal yang dihasilkan dari bakteri E. faecalis untuk mengobati dan mencegah penyakit ini pada ikan nila merah. Studi imunoprofilaksis dan imunoterapi masing-masing menggunakan empat kelompok dengan dua kali ulangan, yaitu kontrol ikan sehat (KS), pelet non-IgY (PA dan TA), pelet dengan 25% kuning telur mengandung IgY spesifik anti-infeksi streptokokal (PB dan TB), dan pelet dengan 50% kuning telur mengandung IgY spesifik anti-infeksi streptokokal (PC dan TC). Analisis data statistik sidik ragam dilakukan pada variabel imun nonspesifik: total leukosit, monosit, limfosit, neutrofil, aktivitas fagositosis, dan kapasitas makrofag. Analisis survival-cox regression juga dilakukan untuk melihat pengaruh variabel imun nonspesifik dan perubahan bobot badan terhadap angka kematian akibat infeksi streptokokal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa formulasi pelet dengan 50% kuning telur dengan konsentrasi IgY sebesar 2,43 mg g-1 pelet adalah yang terbaik pada penelitian yang dilakukan pada ikan uji sebanyak 3% dari bobot badan dengan frekuensi pemberian sekali sehari. Pemberian formulasi ini juga dapat meningkatkan imun nonspesifik berupa total leukosit, monosit, limfosit, neutrofil, aktivitas fagositosis, dan kapasitas makrofag dengan angka kelangsungan hidup sebesar 55% selama 14 hari uji tantang pada studi imunoprofilaksis dan 70% selama 21 hari masa terapi pada studi imunoterapi. Hasil analisis survival-cox regression hanya signifikan pada studi imunoterapi yang menunjukkan bahwa individu ikan dengan kadar limfosit rendah memiliki risiko kematian 52,88 kali lipat lebih cepat dibandingkan individu dengan jumlah limfosit normal.

Berdasarkan rangkaian studi yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa IgY merupakan molekul yang tahan terhadap berbagai tingkat salinitas dan pH air pada lingkungan budidaya ikan nila, namun rentan pada pemanasan suhu 80 °C melebihi 20 menit dan apabila terdapat enzim pepsin. Molekul IgY mampu berperan sebagai aglutinin, inhibin, serta berpotensi sebagai bakterisidal melalui dugaan proses aktivasi komplemen. Studi efikasi menunjukkan adanya efek profilaksis dan terapi terhadap infeksi streptokokal yang disebabkan oleh E. faecalis pada ikan nila merah.

The fishery is one of the leading sectors for Indonesia. One of the fishery commodities included in the top ten priority aquaculture commodities in Indonesia is tilapia. The presence of disease can be a serious threat in an aquaculture environment if its presence is not prevented or treated. Streptococcal bacterial infection is an infectious disease caused by bacteria in aquaculture that mostly attacks tilapia and several other fish species in the world. Antibiotics are common in treating bacterial diseases that trigger resistance globally. Alternative use of antibiotics that can be developed to prevent and treat bacterial diseases is to use immunoglobulin Y (IgY) from chicken egg yolks. The general aim of the study was to explore and evaluate the potential of anti-streptococcal IgY as a basis for immunoprophylaxis and immunotherapy in red tilapia (Oreochromis hybrid). There are three series of studies conducted to achieve this aims. The first study was the biological properties of IgY against various water pH, water salinity, temperature, and the presence of protease enzymes. The study aimed to explore the biological properties of anti-streptococcal IgY on the influence of the aquatic environment, such as pH and salinity; temperature; and the presence of a simulated protease enzyme following the optimal pH and concentration in the digestive tract of tilapia. The method used was to characterize the IgY protein molecule with the Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) method to evaluate the quality of the post-incubation molecule in various treatments and the indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) method to evaluate the IgY molecule quantitatively. The results showed that water salinity (0, 15, and 30 ppt) and water pH conditions (6,5, 7,5, and 8,5) with an incubation period of six days, and incubation temperatures at 25, 45, and 60 °C for 60 minutes did not affect the molecular weight and confirmed positive can still be detected on ELISA. Extreme conditions at 80 °C showed negative results in the ELISA test starting at the minute 40 of the incubation period, but qualitatively it could still be detected well and did not show any change in the molecular weight of the SDS PAGE gel. Incubation on trypsin enzyme for 60 minutes did not affect the molecular weight characteristics of IgY, and ELISA confirmation still showed positive results. However, incubation of the pepsin enzyme for 60 minutes caused the IgY molecule to be lost and could not be detected on the SDS PAGE gel or the ELISA test starting from the minute 40 of the incubation period. The second study is the biological function of the IgY molecule as an agglutinin, inhibin, and its potential as a bactericidal through complement activation. This study aimed to observe the biological function of IgY against Enterococcus faecalis as a cause of streptococcal infection. The method used in the agglutinin function test was conducted by observing the growth of E. faecalis in brain-heart infusion (BHI) broth media which was added with IgY suspension. The function of inhibin was performed using a spectrophotometric method to measure the level of turbidity of the bacterial suspension inoculated with IgY suspension. The bactericidal potential through the complement activation pathway against red tilapia serum was carried out using a scanning electron microscope (SEM) method to evaluate the morphology of the bacterial cell wall. In silico evaluation was also conducted to determine the characteristics of the fragment of complement (Fc) chicken IgY and the tilapia complement C1 receptor. The study results showed that IgY has potential as an agglutinin, inhibin, and bactericidal substance through its potential in putative complement activation in red tilapia commodities. The characteristics of the two proteins were stable and have a tendency to be easily soluble in water solvents. The third study was an in vivo efficacy test of pellets containing anti-streptococcal IgY as immunoprophylaxis and immunotherapy in red tilapia (Oreochromis hybrid). The study aimed to test the efficacy of pellets containing IgY against streptococcal bacteria produced from E. faecalis bacteria to treat and prevent this disease in red tilapia. The immunoprophylaxis and immunotherapy studies each used four groups with two replications, namely healthy control fish (KS), non-IgY pellets (PA and TA), pellets with 25% egg yolk containing specific anti-streptococcal infection IgY (PB and TB), and pellets with 50% egg yolk containing anti-streptococcal infection IgY (PC and TC). Statistical data analysis of variance was performed on non-specific immune variables: total leukocytes, monocytes, lymphocytes, neutrophils, phagocytic activity, and macrophage capacity. Survival-cox regression analysis was also performed to examine the effect of non-specific immune variables and changes in body weight on mortality due to streptococcal infection. The results showed that the pellet formulation of 50% egg yolk with an IgY concentration of 2,43 mg g-1 pellet was the best in a study conducted on test fish as much as 3% of body weight with a frequency of once a day. The administration of this formulation can also increase non-specific immunity in the form of total leukocytes, monocytes, lymphocytes, neutrophils, phagocytic activity, and macrophage capacity with a survival rate of 55% for 14 days of challenge test in immunoprophylaxis study and 70% for 21 days of therapy in immunotherapy study. The results of the survival-cox regression analysis were only significant in an immunotherapy study which showed that fish individuals with low lymphocyte levels had a 52,88-fold higher risk of death than individuals with normal lymphocyte counts. Based on the series of studies conducted, it can be concluded that IgY is a molecule resistant to various levels of salinity and pH of water in the tilapia culture environment but is susceptible to heating at 80 °C for more than 20 minutes and when pepsin is present. IgY molecules can act as agglutinin, inhibin, and can be bactericidal through its potential in putative complement activation. Efficacy studies showed a prophylactic and therapeutic effect against streptococcal infections caused by E. faecalis in red tilapia.