Ekstraksi Protein Alergen dari Biji Kecipir, Belut Sawah dan Tutut untuk Pembuatan Reagen Uji Tusuk Kulit

Abstract

Alergi pangan merupakan suatu kondisi yang tidak diinginkan yang disebabkan oleh reaksi antibodi imunoglobin E (IgE) terhadap protein makanan. Prevalansi jenis alergi terbilang tinggi terutama pada kelompok bayi dan anakanak usia dini. Gejala yang timbul akibat alergi pangan antara lain kulit kemerahan dan gatal, bibir menebal, mual, diare, bersin, sulit bernafas, pusing hingga pingsan. Untuk menghindari alergi tersebut, masyarakat cenderung menghindari makanan yang diduga menimbulkan alergi, terutama makanan berprotein tinggi secara menyeluruh sehingga dapat berdampak buruk bagi pertumbuhan anak-anak karena keterbatasan sumber-sumber protein pangan. Alergenitas protein pangan bersifat tidak menentu, dapat berubah sesuai dengan jumlah, jenis dan kondisi protein serta kondisi fisiologis penderita alergi. Oleh karena itu, diperlukan uji diagnosis alergi agar penderita, khususnya anak-anak, dapat dipastikan protein penyebab alergi pada saat itu sehingga hanya secara selektif menghindari pangan sumber protein alergen tersebut. Tes alergi yang dilakukan untuk mengetahui jenis pangan yang menyebabkan seseorang tersebut alergi pada saat itu adalah Skin Prick Test atau uji tusuk kulit. Pereaksi yang digunakan untuk uji tusuk kulit adalah ekstrak protein pangan. Bahan pangan yang digunakan adalah biji kecipir (Psophocarpus tetragonolobus L), tutut (Filopaludina javanica (von dem Busch, 1844)) dan belut sawah (Monopterus javanensis La Cepéde, 1800). Ketiga jenis makanan lokal ini merupakan sumber protein yang murah dan cukup melimpah di Jawa Barat sehingga anak-anak yang tidak alergi terhadap protein-protein ini tidak perlu menghindari jenis makanan ini. Sejauh ini belum ada penelitian yang spesifik membahas mengenai alergi ketiga sampel bahan makanan tersebut. Pada penelitian ini, ekstraksi protein tutut dan belut sawah menggunakan variasi beberapa macam ekstrak atau bufer. Penggunaan pelarut yang sesuai berperan penting dalam proses ekstraksi protein karena dapat meningkatkan rendemen dan aktivitas protein alergen yang dihasilkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengekstraksi protein alergen dari biji kecipir (segar dan rebus) pada titik isoelektriknya, serta tutut dan belut (segar dan rebus) menggunakan berbagai bufer (bufer tris glisin/TG, bufer tris glisin DTT/TGD, dan bufer posphate bufer saline/PBS) dan mengakarakterisasi ekstrak protein alergen yang dihasilkan dengan uji elektroforesis SDS-PAGE, immunoblotting dan ELISA menggunakan sera 10 subjek hasil seleksi, dan menguji reaktivitas ekstrak protein biji kecipir, tutut dan belut sawah untuk keperluan diagnosis alergi pangan dengan metode uji tusuk kulit pada subjek penderita alergi pangan di klinik alergi. Hasil ekstraksi protein biji kecipir segar (KS) menghasilkan rendemen ekstrak protein sebesar 30.06%. Hasil ekstraksi protein biji kecipir rebus (KR) menghasilkan rendemen ekstrak protein sebesar 1.41%. Hasil ekstraksi protein belut sawah segar menggunakan bufer TG (BSTG) menghasilkan ekstrak protein dengan rendemen sebesar 8.87%, belut sawah segar menggunakan bufer TGD iv (BSTGD) sebesar 4.92% dan belut sawah segar menggunakan bufer PBS (BSPBS) sebesar 3.46%. Hasil ekstraksi protein belut sawah rebus menggunakan bufer TG (BRTG) menghasilkan ekstrak protein dengan rendemen sebesar 3.60%, belut sawah rebus menggunakan bufer TGD (BRTGD) sebesar 2.59% dan belut sawah rebus menggunakan bufer PBS (BRPBS) sebesar 1.93%. Hasil ekstraksi protein tutut segar menggunakan bufer TG, TGD dan PBS menghasilkan ekstrak protein dengan rendemen masing-masing adalah sebesar 7.01%, 14.31% dan 4.84%. Hasil ekstraksi protein tutut rebus menggunakan bufer TG, TGD dan PBS menghasilkan ekstrak protein dengan rendemen masing-masing adalah 4.54%, 4.14% dan 3.65%. Profil protein yang dihasilkan dari biji kecipir segar sebanyak 11 pita (22 kDa-89 kDa), biji kecipir rebus sebanyak 9 pita (22 kDa-73 kDa). Belut segar bufer TG memiliki fraksi protein sebanyak 16 pita (22 kDa-233 kDa), belut segar bufer TGD sebanyak 6 pita (22 kDa-112 kDa) dan belut segar bufer PBS sebanyak 16 pita (22 kDa-93 kDa). Tutut segar bufer TG memiliki 10 fraksi protein (22 kDa-264 kDa), tutut segar bufer TGD dengan 9 fraksi protein (22 kDa-163 kDa), tutut segar bufer PBS memiliki 3 fraksi protein (24 kDa-33 kDa). Belut rebus bufer TG memiliki 7 fraksi protein (24 kDa-267 kDa), belut rebus bufer TGD terdeteksi sebanyak 10 fraksi protein (24 kDa-235 kDa), belut rebus bufer PBS meemiliki 10 fraksi protein (24 kDa-297 kDa). Tutut rebus bufer TG memiliki 4 fraksi protein (24 kDa-141 kDa), tutut rebus bufer TGD memiliki 5 fraksi protein (24 kDa-67 kDa), tutut rebus bufer PBS memiliki 2 fraksi protein yatu 24 kDa dan 26 kDa. Hasil ELISA IgE total dari sera 10 subjek hasil seleksi yang berpartisipasi pada penelitian ini menunjukkan bahwa semua subjek merupakan penderita alergi dengan kadar IgE total berkisar antara 0.068 dan 0.607 OD. Dari hasil IgE spesifik dari subjek juga menunjukkan hasil yang positif sehingga bisa disimpulkan bahwa semua subjek memiliki alergi terhadap protein dari semua komoditi yang digunakan pada penelitian ini. Immunoblotting dapat mendeteksi fraksi protein spesifik yang dapat menimbulkan alergi terhadap penderita alergi. Dari hasil analisis immunoblotting dari sera 10 subjek pada fraksi protein kecipir segar menunjukkan satu fraksi protein berikatan positif dengan IgE pada subjek 1 (24 kDa), satu fraksi protein dari subjek 5 (219 kDa), dua fraksi protein dari subjek 7 (23 kDa dan 29 kDa) dan satu fraksi protein dari subjek 9 (17 kDa). Pada kecipir rebus, dua fraksi protein berikatan positif dengan IgE pada subjek 7 (24 kDa dan 31 kDa) dan subjek 8 (23 kDa dan 31 kDa). Hasil immunoblotting dari sera 10 subjek pada fraksi protein belut sawah, satu fraksi protein berikatan positif dengan IgE pada subjek 2 yaitu BSPBS (101 kDa), tiga fraksi protein pada subjek 4 (BSPBS 78 kDa, BSTGD 25 kDa dan BSTG 25 kDa) dan pada subjek 8, dua fraksi protein BSTGD (23 kDa dan 29 kDa), satu fraksi protein BSPBS (51 kDa), satu fraksi protein BRTG (23 kDa), dan satu fraksi protein BRTGD (23 kDa). Hasil immunoblotting dari sera 10 subjek pada protein tutut menunjukkan fraksi protein berikatan positif dengan IgE pada subjek 1 yaitu satu fraksi protein TSPBS (167 kDa), dua fraksi protein TSTG (28 dan 120 kDa), dua fraksi protein TSTGD (29 kDa dan 125 kDa), untuk subjek 2 yaitu dua fraksi protein TSTG (25 kDa dan 67 kDa), dua fraksi protein TSTGD (64 kda dan 384 kDa), lima fraksi protein TSPBS (23 kDa, 24 kDa, 29 kda, 105 kDa dan 273 kDa), fraksi protein yang berikatan positif pada subjek 3 yaitu satu fraksi protein TSTG (97 kDa), dua v fraksi protein TSTGD (97 kDa dan 117 kDa), satu fraksi protein TSPBS (98 kDa), dan dua fraksi protein TRTG (107 kDa dan 137 kDa), fraksi protein yang berikatan positif dengan IgE pada subjek 4 yaitu tiga fraksi protein TSTG (25 kDa, 87 kDa dan 489 kDa), tiga fraksi protein TSTGD (25 kDa, 94 kDa dan 501 kDa), tiga fraksi protein TSPBS (24 kDa, 100 kDa dan 450 kDa), satu fraksi protein TRTG (25 kDa), satu fraksi protein TRTGD (25 kDa) dan satu fraksi protein TRPBS (24 kDa), fraksi protein yang berikatan positif dengan IgE pada subjek 5 yaitu satu fraksi protein TSTG (28 kDa), TSTGD (28 kDa), TSPBS (26 kDa), tiga fraksi protein TRTG (22 kDa, 23 kDa dan 29 kDa), satu fraksi protein TRTGD (28 kDa) dan satu fraksi protein TRPBS (26 kDa), fraksi protein yang berikatan positif dengan IgE pada subjek 6 yaitu satu fraksi protein TSTG (77 kDa), TSTGD (66 kDa), dua fraksi protein TSPBS (24 kDa dan 62 kDa), subjek 8 yaitu satu fraksi protein TSTG (145 kDa), TSTGD (138 kDa),dan fraksi protein yang berikatan positif dengan IgE pada subjek 9 satu fraksi protein TSTG (61 kDa), dua fraksi protein TSTGD (21 kDa dan 68 kDa), dan satu fraksi protein TSPBS (74 kDa). Hasil uji tusuk kulit untuk semua sampel pada semua subjek memperlihatkan hasil yang bervariasi dari +1 sampai +4. Beberapa subjek menunjukkan hasil yang negatif pada uji tusuk kulit walaupun dari hasil IgE spesifiknya terhadap sampel tersebut positif. Ukuran bentol pada uji tusuk kulit yang mengandung protein tutut lebih besar daripada ukuran bentol pada sampel protein belut. Ukuran bentol pada protein tutut mencapai +4 pada beberapa subjek, sedangkan pada protein belut hanya mencapai ukuran +3 pada beberapa subjek. Hal ini dikarenakan tidak semua fraksi dalam ekstrak protein bersifat alergen, demikian pula reaksi pada masing-masing subjek bisa berbeda terhadap protein yang sama.