Desain sgRNA untuk Pengeditan Gen ROC5 dengan CRISPR/Cas9 dan Prediksi Mutasi secara in silico pada Padi Kultivar Hawara Bunar

Abstract

Produktivitas padi (Oryza sativa L.) perlu ditingkatkan salah satunya dengan ekstensifikasi penanaman pada lahan suboptimal. Hawara Bunar merupakan kultivar padi toleran cekaman kekeringan dan tanah masam yang berpotensi ditanam di lahan suboptimal. Untuk mengoptimalkan hasil panen pada kondisi lahan tersebut, diperlukan pemuliaan untuk menghasilkan padi kultivar Hawara Bunar yang menunjukkan penggulungan daun secara moderat ketika tercekam kekeringan melalui pengeditan gen ROC5 menggunakan sistem CRISPR/Cas9. Langkah awal dalam pengeditan gen ini adalah desain sgRNA dan prediksi mutasi yang akan dihasilkan baik pada sekuen gen maupun protein dari ROC5. Penelitian ini bertujuan mendesain sgRNA dengan efisiensi yang tinggi dan memprediksi mutasi secara in silico dalam pengeditan gen ROC5 pada padi kultivar Hawara Bunar menggunakan sistem CRISPR/Cas9. Penelitian ini dilakukan melalui analisis in silico. Hasil penelitian ini adalah desain sgRNA untuk pengeditan gen ROC5 padi kultivar Hawara Bunar menggunakan sistem CRIPR/Cas9 yaitu 5’-GGAGGCTCTCCCTCGATGCG-3’ dengan PAM 5’-CGG-3’ dan 5’-CTGAGG CGGAGAACGACAGC-3’ dengan PAM 5’-CGG-3’. Kedua sgRNA tersebut masing-masing diprediksi akan memandu mutasi pada ekson ketiga (posisi genomik ke-27493819) dan kedua (posisi genomik ke-27494141) untuk menyebabkan mutasi delesi 5 pb dan insersi 1 pb dan menghasilkan protein ROC5 mutan yang tidak fungsional. Oligodupleks berdasarkan kedua sgRNA tersebut juga telah didesain.

The productivity of rice (Oryza sativa L.) needs to be increased. One of efforts is by extensification of rice cultivation on suboptimal land. Hawara Bunar is a rice cultivar that is tolerant to drought stress and acid soil which has the potential to be cultivated on suboptimal land. To optimize yields in such conditions, it is necessary to develop rice cv. Hawara Bunar that show moderate leaf curling when grown under drought stress through editing the ROC5 gene using the CRISPR/Cas9 system. The initial step of this gene editing are the design of sgRNA and prediction of mutations that will be generated in the gene and protein sequences of ROC5 gene. This study aims to design a high efficiency sgRNA for CRISPR/Cas9 based gene editing and predict mutations that will occur in the edited ROC5 gene in rice cv. Hawara Bunar. The research was conducted through in silico analysis. The result of the study was the sgRNA for ROC5 gene editing in rice cv. Hawara Bunar using the CRIPR/Cas9 system has been developed with the sequence of 5'-GGAGGCT CTCCCTCGATGCG-3' with PAM 5'-CGG-3' and 5'-CTGAGGCGGAGAACG ACAGC-3' with PAM 5'-CGG-3'. These two sgRNAs were predicted to guide mutations in the third (at 27493819 genomic position) and second (at 27494141 genomic position) exons of the ROC5 gene to generate a 5 bp deletion and 1 pb insertion, respectively, and produce a non-functional mutant ROC5 protein. Oligoduplex based on both sgRNAs also has been designed.