Pengaruh Peptida Sinyal dan Promoter Pada Ekspresi Lipase Novel Dari Micrococcus luteus EMP48-D di Escherichia coli

Abstract

Lipase (triasilgliserol asilhidrolase EC 3.1.1.3) merupakan enzim hidrolitik yang dapat menghidrolisis trigeliserida menjadi asam lemak bebas dan gliserol. Lipase dimanfaatkan dalam beberapa industri, seperti makanan, susu, farmasi, tekstil, surfaktan, pakan ternak, kosmetik, dan biodiesel. Mengingat banyaknya manfaat dari enzim ini, eksplorasi lipase semakin gencar dilakukan, salah satunya dengan rekayasa protein rekombinan baik secara homolog maupun heterolog. Pada penelitian sebelumnya gen penyandi lipase EMP48-D telah berhasil diisolasi dari Micrococcus luteus yang merupakan bakteri yang terdapat di tempe. Gen lipase EMP48-D ini dapat terkekspresi di Escherichia coli, meskipun memiliki aktivitas yang masih rendah. Lipase EMP48-D memiliki karakter unik yaitu dapat bekerja di pH asam (lipase asam). Penelitian terkait lipase asam masih sangat jarang jika dibandingkan dengan eksplorasi lipase golongan alkali. Aktivitas lipase yang diperoleh pada penelitian tersebut masih sangat kecil dan terdapat di intraseluler. Oleh sebab itu pada penelitian ini promoter (T7 dan T5) digunakan untuk memperoleh aktivitas yang lebih tinggi, dan peptida sinyal (ompA, M. lut dan pelB) digunakan untuk sekresi protein rekombinan secara ekstraseluler. Pada penelitian ini gen lipase EMP48-D terlebih dahulu diklon ke dalam plasmid pBSP dengan backbone pET28-a, dengan beberapa variasi yaitu T7_M.lut_EMP, T7_ompA_EMP, T7_pelB_EMP, T5_ompA_EMP, T5_pelB_EMP, dan T7_EMP kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α. Seluruh plasmid rekombinan diekspresikan ke dalam E. coli BL21 (DE3) pLysS dengan T7_EMP sebagai kontrol. Ekspresi lipase EMP48-D diinduksi dengan IPTG 0,5 mM di suhu 30 ⁰C dengan waktu induksi selama 5 jam dan agitasi 200 rpm. Perbedaan nilai OD600 terjadi pada perlakukan induksi dan non induksi yang diamati pada ekspresi T7_M.lut_EMP dan T7_ompA_EMP. Kultur yang diinduksi menunjukkan pertumbuhan yang lebih lambat dibandingkan dengan yang tidak diinduksi. Perbedaan jumlah sel mengindikasikan inang mengalami penghambatan pertumbuhan sel, karena ekspresi dari lipase EMP48-D. Penambahan peptida sinyal (M. luteus, ompA dan pelB) dalam sekresi lipase EMP48-D memberikan pengaruh yang baik dalam translokasi lipase EMP48-D. Pemberian peptida sinyal (M. luteus, ompA dan pelB) menunjukkan pengaruh dalam jumlah translokasi lipase EMP48-D baik yang di kontrol oleh promoter T7 maupun T5. Lipase EMP48-D yang terfusi dengan ompA dan dikontrol promoter T7 memiliki aktivitas spesifik ekstraseluler tertinggi, yaitu 418 U mg-1. Hasil ini diikuti oleh fusi dengan peptida sinyal asli M. luteus (292 U mg-1), pelB (125 U mg-1), dan tanpa peptida sinyal (56 U mg-1). Lipase EMP48-D yang terfusi dengan peptida sinyal ompA di bawah pengaruh promoter T5 juga menunjukkan aktivitas spesifik ekstraseluler tertinggi, yaitu 133 U mg-1 dan pelB hanya 74 U mg-1. Di daerah periplasma dan intraselulur, lipase EMP48-D fusi ompA yang dikontrol oleh promoter T5 memiliki aktivitas tertinggi yaitu 107 U mg-1 dan 33 U mg-1. Ekspresi lipase EMP48-D di bawah kontrol promoter T7 lebih tinggi dari promoter T5, sekitar 1,8 kali dengan ompA, dan 1,3 kali dengan pelB. Oleh karena itu, peptida sinyal ompA, di bawah kendali promoter T7, adalah yang paling efektif dalam ekspresi ekstraseluler lipase EMP48-D. Lipase EMP48-D menunjukkan aktivitas spesifik optimum pada suhu 40 °C (95%) dan optimum pada pH 5 (100%). Penggunaan berbagai jenis substrat juga memberikan pengaruh terhadap aktivitas lipase EMP48-D, yaitu minyak zaitun (100%), minyak sawit (64%), kanola (64%) minyak jagung (64%), minyak kedelai (59%), minyak bunga matahari (55%), dan minyak dedak padi (50%). Protein lipase EMP48-D juga terdeteksi pada SDS-PAGE dengan ukuran 43,1 kDa (420 residu) berdasarkan analisis bioinformatik.

Lipase (triacyl glycerol acyl hydrolase EC 3.1.1.3) is a hydrolytic enzyme that can hydrolyze triglycerides into free fatty acids and glycerol. Lipase is utilized in several industries, such as food, milk, pharmacy, textile, surfactant, animal feed, cosmetic, and biodiesel. Noticing many benefits from this enzyme, the lipase exploration is massively conducted by one of which is recombinant protein manipulation either homologous or heterologous. In a previous study, the EMP48-D gene encoding lipase enzyme has been successfully isolated from Micrococcus luteus as bacteria found in tempeh. This EMP48-D lipase gene can also be expressed in Escherichia coli, although showing a lower activity. The EMP48-D lipase gene has a unique characteristic as capable of working at acidic pH (acidic lipase). Related studies about acidic lipase is still rarely performed compared to the exploration of alkaline lipase groups. The lipase activity obtained from the following studies was still very small and found intracellularly. Therefore, in this study, promoter optimization (T7 and T5) was used to obtain a higher activity, followed by signal peptide optimization (ompA and pelB) to extracellularly secrete recombinant protein. In this study, the EMP48-D lipase gene was initially cloned into the pBSP plasmid with the pET28-a backbone through several variations, namely T7_M.lut_EMP, T7_ompA_EMP, T7_pelB_EMP, T5_ompA_EMP, T5_pel_EMP, and T7_EMP then were introduced into E. coli DH5α. All of recombinant were expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS with T7_EMP as control. The EMP48-D lipase was expression was induced with 0,5 mM IPTG at 5 hours, 30 °C, and 200 rpm agitation. Difference of OD600 was occurred in the induction and non-induction treatments as observed from the expression of T7_M.lut_EMP and T7_ompA_EMP. The induced culture had a slower growth than the non-induced culture. Difference of total cells indicates that the cell growth inhibition is occurred on the host due to the EMP48-D lipase expression. The signal peptide addition (M. luteus, ompA, and pelB) in the EMP48-D lipase secretion provided a good influence in the EMP48-D lipase translocation either controlled by the T7 or T5 promoter. The signal peptide addition (M. luteus, ompA, and pelB) in the EMP48-D lipase secretion provided a good influence in the EMP48-D lipase translocation. The EMP48-D lipase fused with ompA and controlled by T7 promoter obtained the highest extracellular specific activity at 418 U mg-1. This result was followed by the fusion of M. luteus origin signal peptide (292 U mg-1), pelB (125 U mg-1), and without signal peptide (56 U mg-1). The EMP48-D lipase fused with the ompA signal peptide under the T5 promoter influence also obtained the highest extracellular specific activity at 133 U mg-1 and pelB only obtained at 74 U mg-1. Around the periplasm and intracellular regions, the ompA fused EMP48-D lipase controlled by the T5 promoter obtained the highest activity at 107 U mg-1 and 33 U mg-1. The EMP48-D lipase expression controlled by the T7 promoter was higher than controlled by the T5 promoter, as 1,8 times higher in ompA, and 1,3 times higher in pelB. Therefore, the ompA signal peptide controlled by the T7 promoter is the most effective extracellular expression of EMP48-D lipase. The EMP48-D lipase had the optimum specific activity at 40℃ (95%) and pH 5 (100%). The use of several substrate types also influenced the activity of EMP48-D lipase, such as olive oil (100%), palm oil (64%), canola (64%), corn oil (64%), soybean oil (59%), sunflower oil (55%), and rice bran oil (50%). EMP48-D lipase protein was also detected on SDS-PAGE with a size of 43,1 kDa (420 residues) based on bioinformatic analysis.