Bacteriocin-like Inhibitory Substances Produksi Streptomyces sp. yang Berasosiasi dengan Ikan Bandeng (Chanos chanos)

Abstract

Kontaminasi mikroorganisme menyebabkan kerusakan pangan dan penyakit bawaan pangan. Salah satu strategi pencegahan masalah tersebut adalah aplikasi bahan pengawet alami seperti bakteriosin. Bakteriosin merupakan peptida antibakteri yang disintesis secara ribosomal oleh bakteri. Mayoritas bakteriosin diproduksi oleh bakteri asam laktat. Namun, hanya nisin (bakteriosin produksi L. lactis) yang telah diizinkan aplikasinya secara luas. Beragam sumber untuk mendapatkan bakteri penghasil atau bahkan bakteriosin baru sebagai alternatif nisin dapat dieksplorasi, salah satunya adalah bakteriosin yang dihasilkan oleh Streptomyces yang berasosiasi dengan ikan bandeng (Chanos chanos). Kemampuan adaptasi pada berbagai ekosistem dan membentuk asosiasi dengan inang eukariotik diduga memberikan Streptomyces kapasitas fisiologis dan genetik untuk mengekspresikan metabolit unik dengan berbagai bioaktivitas. Streptomyces menjadi genus yang menjanjikan namun masih sedikit dipertimbangkan. Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi isolat Streptomyces penghasil bakteriosin atau BLIS, serta memurnikan, mengkarakterisasi dan mengidentifikasi bakteriosin atau bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) yang diproduksi Streptomyces sp. Tujuan khusus dari penelitian ini adalah: 1) mengidentifikasi isolat bakteri penghasil bakteriosin atau bacteriocinlike inhibitory substances yang potensial, 2) menganalisis dan mengidentifikasi medium dan waktu produksi terbaik dari BLIS yang dihasilkan oleh ke-enam isolat Streptomyces terpilih, 3) menganalisis BLIS yang telah dimurnikan sebagian hingga BLIS murni yang didapatkan dari proses fraksinasi tiga tahap, 4) menganalisis toksisitas (LC50) dan stabilitas BLIS terhadap suhu tinggi dan pH berbeda, 5) mengidentifikasi peptida BLIS yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri menggunakan HR-LC-ESI-MS-MS, dan 6) mengidentifikasi sifat fisikokimia peptida secara in silico dan studi penambatan molekuler terhadap protein target penicillin-binding protein 3 yang dimiliki methicillin resistant S. aureus. Penelitian ini dilaksanakan dalam lima tahapan. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk mengidentifikasi karakteristik isolat A12 dan A17, menganalisis potensi metabolit antibakteri yang dihasilkan, dan mengidentifikasi profil metabolit antibakteri. Hasil dari tahapan ini menambah jumlah isolat yang berasosiasi dengan ikan bandeng yang mampu menghasilkan metabolit antibakteri potensial, yang mana pada penelitian sebelumnya telah didapatkan sebanyak empat isolat (S5, S8, S11 dan A10). Penelitian tahap kedua bertujuan untuk menganalisis medium dan waktu produksi terbaik untuk produksi metabolit antibakteri yang dihasilkan oleh ke-enam isolat (S5, S8, S11, A10, A12 dan A17). Penelitian tahap ketiga bertujuan untuk menseleksi isolat bakteri penghasil BLIS, analisis aktivitas antibakteri dan stabilitas terhadap suhu tinggi dan kisaran pH luas dari crude-BLIS dan analisis aktivitas antibakteri fraksi BLIS berberat molekul <3, 3-10 dan >10 kDa hasil fraksinasi dengan membran ultrafiltrasi. Fraksi BLIS-UF dengan aktivitas antibakteri menjanjikan dilanjutkan analisis ke tahap penelitian ke-empat. Tahap ke-empat bertujuan untuk menganalisis aktivitas fraksi BLIS-filtrasi gel (BLIS-GF) hasil fraksinasi lanjut dengan kromatografi filtrasi gel (Sephadex G-25), menganalisis toksisitas (LC50) dengan metode brine-shrimp lethality assay dan stabilitas BLIS-GF pada suhu tinggi dan kisaran pH yang luas, mengidentifikasi prediksi urutan peptida BLIS berdasarkan analisis dengan HR-LC-ESI-MS-MS yang diikuti analisis multivariat OPLS dan analisis in silico, dan mengidentifikasi sifat fisikokimia dan prediksi probabilitas peptida antibakteri secara in-silico. Fraksi BLIS-GF dengan aktivitas potensial dilanjutkan ke analisis tahap ke-lima, yang mana tahap ini bertujuan untuk mempurifikasi fraksi BLIS-GF dengan RPHPLC hingga didapatkan BLIS, murni mengetahui aktivitas antibakteri BLIS murni, mengevaluasi toksisitas (LC50) dengan metode brine-shrimp lethality assay dan stabilitas BLIS murni pada suhu tinggi dan pH berbeda, mengidentifikasi urutan peptida BLIS-GF dengan HR-LC-ESI-MS-MS, mengidentifikasi sifat fisikokimia dan struktur sekunder BLIS murni secara in silico, dan melakukan studi penambatan molekuler pada BLIS murni terhadap penicillin binding protein (PBP3) yang dimiliki oleh methicillin resistant S. aureus. Hasil penelitian tahap pertama menunjukkan isolat teridentifikasi Streptomyces sp. mampu menghasilkan metabolit antibakteri dengan spektrum penghambatan luas. Pada penelitian tahap kedua, isolat diketahui memproduksi senyawa antibakteri secara optimum pada medium produksi yeast-malt extract broth dengan masa inkubasi 9 hingga 11 hari. Pada penelitian tahap ketiga, uji aktivitas antibakteri dan analisis sifat protein menunjukkan Streptomyces sp. mampu memproduksi peptida antibakteri sebagai bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS). BLIS-Streptomyces (dalam bentuk crude-BLIS) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram-positif dan Gram-negatif, dan stabil terhadap panas (hingga 100 C) dan kisaran pH yang luas (pH 2.0 – 7.0). Fraksinasi dengan membran ultrafiltrasi menunjukkan fraksi <3 kDa dan fraksi 3-10 kDa merupakan fraksi paling aktif. Pada penelitian tahap ke-empat, fraksinasi lanjut dengan kromatografi filtrasi gel (Sephadex G-25) terhadap fraksi BLIS aktif menghasilkan masing-masing 8 fraksi BLIS filtrasi gel (BLIS-GF). Fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel juga menunjukkan tren peningkatan aktivitas spesifik-BLIS. Prediksi peptida yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri menggunakan pendekatan analisis HR-LC-ESI-MS-MS diikuti analisis multivariat OPLS menemukan 597 peptida prediksi. Sebanyak 42 dari 597 peptida prediksi dengan karakteristik peptida antimikroba dan probabilitas peptida antimikroba berdasarkan iAMPpred tertinggi (>0.5) dipilih. Peptida prediksi terpilih memiliki massa molekul rendah (247.13-615.37 Da), muatan bersih -2 hingga +2, terdiri dari minimal 20 % asam amino hidrofobik, dan memiliki hidrofobisitas hingga 14.72 Kkal mol o . Pada tahap ke-lima, fraksi BLIS-GF dengan aktivitas potensial dimurnikan dengan RP-HPLC dengan deteksi pada 280 nm hingga mendapatkan BLIS murni. Pada kondisi murni, aktivitas spesifik-BLIS meningkat secara signifikan hingga 275.9 kali lipat. Selain itu, BLIS murni juga mampu mempertahankan lebih dari 50% aktivitasnya hingga suhu 100 -1 C dan pH 2.0 – 7.0. Identifikasi isolat peptida BLIS murni (kemurnian 78.71 – 88.93% berdasarkan total area integrasi) dengan HR-LC-ESI-MS-MS diikuti analisis bioaktivitas secara in-silico pada basis data peptida antibakteri dan bakteriosin menunjukkan peptida BLIS murni memiliki urutan asam amino yang tidak o ditemukan homologinya dengan bakteriosin atau peptida antimikroba lain sehingga peptida BLIS murni diduga merupakan bakteriosin baru. Studi in silico untuk mengetahui sifat fisikokimia BLIS murni menunjukkan ke-empat BLIS murni mengandung 50 – 86.4% asam amino hidrofobik, memiliki berat molekul berkisar 1287.51 – 1812.85 Da, muatan bersih -4 hingga +2, titik isoelektrik 2.68 – 11.71, hidrofobisitas 20.44 – 27.46 Kkal mol , dan indeks terapi prediksi 5.41 – 91.30. Studi penambatan molekuler dari peptida BLIS murni terhadap protein PBP-3 methicillin-resistant S. aureus menunjukkan nilai energi pengikatan (binding energy) yang rendah (-7.5 hingga -8.1 Kcal mol -1 , indeks Boman 0.3 – 2.13 kkal mol -1 ), jumlah ikatan hidrogen berkisar 17-25 ikatan dengan jarak terdekat 1.78 Å dan mayoritas interaksi terjadi pada sisi aktif PBP-3. Konfirmasi penambatan molekuler dengan MDockPeP menunjukkan nilai docking score (skor penambatan) yang rendah berkisar -143.656 hingga 176.037. Hasil ini menunjukkan bahwa peptida BLIS murni mampu menambat secara spontan pada protein PBP-3, dan mampu membentuk interaksi yang baik dan stabil antara peptida (ligan) dan protein, serta kemampuan peptida dalam menghambat sintesis dinding atau membran sel bakteri melalui pengikatan pada prekursor pensintesisnya. Secara keseluruhan, hasil penelitian ini mengungkapkan potensi Streptomyces sp. dalam menghasilkan bakteriosin atau bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS). Fraksinasi tiga tahap menggunakan membran ultrafiltrasi, kromatografi filtrasi gel dan RP-HPLC mampu memurnikan BLIS hingga mendapatkan BLIS murni, serta meningkatkan aktivitas spesifik-BLIS hingga 275.9 kali lipat. Berdasarkan hasil analisis dan identifikasi, BLIS Streptomyces memiliki stabilitas yang baik pada suhu tinggi (hingga 100 -1 C) dan kisaran pH yang luas (pH 2.0 – 7.0), serta memiliki urutan asam amino yang tidak homolog dengan urutan asam amino peptida antimikroba atau bakteriosin lain sehingga diduga merupakan bakteriosin baru. Berdasarkan aktivitas, stabilitas dan sifat yang ditunjukkan, BLIS-Streptomyces berpotensi digunakan sebagai bahan pengawet alami pada pangan.

Microorganism contamination causes food spoilage and foodborne disease. One strategy to prevent this problem is the application of natural preservatives such as bacteriocins. Bacteriocins are antibacterial peptides synthesized ribosomally by bacteria. Lactic acid bacteria produce the majority of bacteriocins. However, only nisin (a bacteriocin produced by L. lactis) has been widely used. Various sources to obtain producing bacteria or even new bacteriocins as alternatives to nisin can be explored, one of which is the bacteriocin produced by Streptomyces associated with milkfish (Chanos chanos). The ability to adapt to various ecosystems and form associations with eukaryotic hosts gives Streptomyces the physiological and genetic capacity to express unique metabolites with various bioactivities. Streptomyces is a promising genus, but it is still little considered. The purpose of this study was to explore the bacteriocin-producing Streptomyces isolates and to purify, characterize and identify the bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) produced by Streptomyces sp. The specific objectives of this study were: 1) to identify potential isolates of bacteria producing bacteriocinlike inhibitory substances, 2) analyzed and identified the best medium and production time of BLIS produced by the six selected Streptomyces isolates, 3) to analyze semi-purified BLIS and purified-BLIS obtained from three-step fractionation, 4) analyze the toxicity (LC50) and stability of BLIS against high temperature and wide-range of pH, 5) identify the BLIS peptide responsible for antibacterial activity using HR-LC-ESI-MS-MS, and 6) identify the physicochemical properties of the peptide in silico and molecular docking studies of the target protein (PBP-3) of methicillin-resistant S. aureus. This research consists of five stages. The first phase of the study aimed to identify the characteristics of isolates A12 and A17, analyze the potential of the antibacterial metabolites produced, and identify the profile of antibacterial metabolites. This stage is a follow-up study from previous studies, in which four isolates (S5, S8, S11 and A10) were identified that we're able to produce metabolites suspected of being protein with potential antibacterial activity. The second stage of the study aimed to analyze the best medium and time for producing the antibacterial metabolites produced by the six isolates (S5, S8, S11, A10, A12 and A17). The third stage of the study aimed to analyze the antibacterial activity of BLIS with molecular weight <3, 3-10 and >10 kDa fractionated using ultrafiltration membrane (BLIS-UF) and to analyze the stability of BLIS-UF at high temperature and wide-range of pH. BLIS-UF with promising antibacterial activity, continued the analysis to the fourth stage. The fourth stage aims to analyze the activity of BLIS-gel filtration (BLIS-GF) fractionated using gel-filtration chromatography, analyze the toxicity (LC50) and stability of BLIS-GF at high-temperature and widerange of pH, identified BLIS peptide sequences based on HR-LC-ESI-MS-MS followed by multivariate OPLS and in-silico analysis, and identified physicochemical properties and predicted probabilities as candidates for antimicrobial peptides in-silico. BLIS-GF with potential activity was further analyzed in the fifth stage of the study. This stage aimed to purify the BLIS-GF fraction with RP-HPLC to obtain purified-BLIS, determining the antibacterial activity of purified-BLIS, evaluate the toxicity and stability of purified-BLIS at high temperature and different pH, identified the BLIS-GF peptide sequence with HR-LC-ESI-MS-MS, identified the physicochemical properties and secondary structure of purified-BLIS in-silico, and molecular docking study of purified-BLIS against penicillin-binding protein- 3 (PBP-3). The first stage of the study showed that isolates A12 and A17 were part of the genus Streptomyces sp. Both isolates were also able to produce metabolites suspected of having protein potential as antibacterial with a broad spectrum of inhibition. These results increase the number of Streptomyces isolates isolated from the digestive tract of milkfish, which are capable of producing antibacterial metabolites found in previous studies (isolates S5, S8, S11 and A10). In the second stage of the study, six isolates were found to identify the optimum antibacterial metabolite production medium and time. The analysis results showed that all isolates could produce antibacterial compounds optimally in yeast-malt extract broth production medium with an incubation period of 9 to 11 days. In the third stage of the study, the antibacterial activity test and analysis of protein properties showed that Streptomyces sp. can produce antibacterial peptides as bacteriocin or bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS). BLIS-Streptomyces (in crude-BLIS form) showed antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria and were stable to high temperatures (up to 100 C) and a wide-range of pH (pH 2.0 – 7.0). Fractionation with ultrafiltration membrane showed <3 kDa fraction, and 3-10 kDa fraction was the most active BLIS fraction. The fraction showed increased antibacterial activity and stability to pH and high temperature in the same range. In the fourth stage of the study, fractionation using gel-filtration chromatography (Sephadex G-25) to the active BLIS fraction resulted in 8 fractions of BLIS-gel filtration (BLIS-GF) each the fraction eluted at the beginning of the retention time had high BLIS-specific activity. Fractionation by gel filtration chromatography also showed an increasing trend of BLIS-specific activity. Prediction of peptide identification in the BLIS-GF by HR-LC-ESI-MS-MS followed by multivariate OPLS and in-silico analysis found 42 peptides (dipeptide to pentapeptide) responsible for antibacterial activity in E. coli, S. aureus, L. monocytogenes and S. Typhimurium. These peptides have a low molecular weight (247.13 – 614.37 Da), contain at least 20% hydrophobic amino acids in their sequence, are anionic and cationic, and have moderate to high hydrophobicity. Prediction of the bioactivity of the 42 peptides using iAMPpred showed that the majority of peptides had a high probability (>0.5) as antimicrobial peptide candidate. In the fifth stage, the BLIS-GF fraction with potential activity was purified by RP-HPLC with detection at 280 nm to obtain purified-BLIS. In purifiedBLIS conditions, BLIS-specific activity increased significantly up to 275.9 times. In addition, purified-BLIS can maintain more than 50% of its activity up to a temperature of 100 o C and a pH of 2.0 – 7.0. Identification of purified-BLIS (purity 78.71 – 88.93% based on a total area of integration) with HR-LC-ESI-MS-MS followed by in-silico analysis on antibacterial peptide databases (APD3) and bacteriocin database (BACTIBASE) showed no bacteriocin or other antimicrobial peptide sequences homologous to purified-BLIS amino acid sequences were found. o This indicates that the purified-BLIS peptide is a novel bacteriocin or antimicrobial peptide. An in-silico study to determine the physicochemical properties of purifiedBLIS showed that the four purified-BLIS contained 50 – 86.4% hydrophobic amino acids, had molecular weights ranging from 1287.51 – 1812.85 Da, net charge -4 to +2, isoelectric point 2.68 – 11.71, hydrophobicity 20.44 – 27.46 Kcal mol-1, Boman index 0.3 – 2.13 kcal mol-1, and predictive therapeutic index 5.41 – 91.30. Molecular docking study of purified-BLIS against methicillin-resistant S. aureus PBP-3 protein showed a low binding energy value (-7.5 to -8.1 Kcal mol-1), the number of H-bonds ranged from 17-25 bonds with the closest distance of 1.78. and the majority of interactions occur at the active site of PBP-3. Molecular docking confirmation with MDockPeP showed low docking scores ranging from -143.656 to 176,037. These results indicate that the purified-BLIS peptide can bind spontaneously to the PBP-3 and can interact stably on the target protein, and the ability of the peptide to inhibit bacterial cell wall or membrane synthesis through binding to its synthesizing precursor. Overall, the results of this study reveal the potential of Streptomyces sp. in producing bacteriocin or bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS). Three-step fractionation using ultrafiltration membrane, gel-filtration chromatography and RPHPLC was able to purify BLIS to obtain purified-BLIS and increase BLIS-specific activity up to 275.9 times. Based on the analysis and identification results, BLISStreptomyces has good stability at high temperatures (up to 100 C) and a wide pH range (pH 2.0 – 7.0), and has an amino acid sequence that is not homologous to the amino acid sequence of other antimicrobial peptides or bacteriocins. This indicates that the four purified-BLIS are thought to be new bacteriocins. Based on the activity, stability and properties shown, BLIS-Streptomyces can be used as a biopreservative in food.