Potensi Sperm Bovine Protamine dan Transition Nuclear Protein sebagai Biomarker Kualitas Semen Sapi di Indonesia

Abstract

Parameter kualitas semen yang rutin dievaluasi sebagai dasar penentu fertilitas pejantan seperti konsentrasi, morfologi, dan motilitas spermatozoa tidaklah cukup untuk memprediksi fertilitas pejantan. Gen dan protein dalam spermatozoa dan seminal plasma yang dikombinasikan dengan pengujian kualitas semen sebagai biomarker telah banyak dilaporkan dan dianggap lebih efektif. Protamin (PRM) merupakan protein dasar pada nukleus spermatozoa yang berfungsi dalam pengemasan DNA spermatozoa secara optimal sehingga terjadi peningkatan kondensasi kromatin yang akan melindungi integritas genetik genom paternal. Ekspresi PRM yang rendah berkaitan erat dengan infertilitas dengan berbagai penurunan kualitas semen seperti konsentrasi, motilitas, peningkatan abnormalitas morfologi dan kerusakan DNA spermatozoa. Penonaktifan gen TNPs pada manusia dilaporkan akan mengakibatkan penurunan fertilitas yang ditandai dengan adanya penurunan konsentrasi, motilitas, viabilitas, peningkatan kerusakan kromatin DNA dan abnormalitas morfologi spermatozoa. Protein-protein transisi (TNPs) merupakan protein yang terdapat pada inti spermatozoa yang terdiri atas TNP1 dan TNP2. Gen atau protein TNP 2 berperan dalam menghentikan proses transkripsi gen dari histon, yang kemudian TNP 1 akan berperan menstimulasi perbaikan DNA yang terputus selama pengangkatan histon. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk menganalisa karakteristik semen beku pada berbagai rumpun pejantan sapi di Indonesia. Semen beku yang digunakan dalam penelitian berasal dari 6 ekor sapi pejantan Limousin, FH, PO, dan 4 ekor sapi pejantan aceh. Karakteristik semen beku yang dievaluasi meliputi motilitas, viabilitas, integritas membran plasma, abnormalitas morfologi, integritas akrosom, aktivitas membran mitokondira, dan kerusakan DNA spermatozoa. Analisis motilitas spermatozoa (progressive motility, total motility, non motile) dilakukan menggunakan computer-assisted semen analysis, sedangkan viabilitas spermatozoa dianalisa menggunakan pewarnaan eosin-nigrosin. Integritas membran plasma spermatozoa dianalisa menggunakan hypoosmotic swelling test, dan abnormalitas morfologi spermatozoa dianalisa menggunakan metode pewarna carbolfuchsin-eosin. Integritas akrosom dianalisis menggunakan metode pewarnaan FITC-PNA, dan aktivitas membran mitokondira spermatozoa dianalisis menggunakan JC-1. Evaluasi kerusakan DNA dilakukan dengan menggunakan pewarnaan acridine orange (AO) dan bos halomax. Karakteristik semen pada semua parameter kualitas berbeda nyata (P<0,05) antar rumpun pejantan sapi, kecuali pada abnormalitas sekunder (P>0,05). Membran mitokondria spermatozoa berhubungan erat (P<0,01; P<0,01) dengan progressive motility, total motility, non motile. Karakteristik kualitas semen antar rumpun pejantan bervariasi dan berbeda nyata antar rumpun, meskipun secara keseluruhan kualitas semen pada masing-masing parameter masih tergolong normal dan baik digunakan untuk inseminasi buatan. Penelitian tahap kedua bertujuan untuk menganalisa ekspresi relatif dari gen PRM1, PRM2, PRM3, TNP1, dan TNP2 pada spermatozoa berbagai rumpun sapi pejantan di Indonesia dan menganalisa potensinya sebagai biomarker kualitas dan produksi semen. Semen beku yang digunakan dalam penelitian berasal dari 6 ekor sapi pejantan Limousin, FH, PO, dan 4 ekor sapi pejantan aceh. Setiap pejantan dikelompokkan menjadi dua kelompok yakni produksi tinggi dan rendah, berdasarkan kapasitas produksi semen beku selama ± 6 bulan. Analisis ekspresi gen PRM1, PRM2, PRM3, TNP1, TNP2, dan PPIA (housekeeping gene) pada semen beku tersebut dilakukan menggunakan RT-PCR. Korelasi ekspresi gen dengan parameter kualitas semen pada tahapan ini menggunakan hasil evaluasi karakteristik semen pada tahap 1. Ekspresi relatif gen PRM1 secara signifikan paling tinggi (P<0,05) dibandingkan gen PRM2, PRM3, TNP1 dan TNP2 pada semua rumpun pejantan. Gen PRM1, TNP1 dan TNP2 secara signifikan terekspresi lebih tinggi (P<0,05) pada kelompok produksi tinggi dibandingkan kelompok produksi rendah. Gen TNP1 dan TNP2 berhubungan erat (P<0,05; P<0,01) dengan motilitas progresif, abnormalitas kepala spermatozoa, dan kerusakan DNA. PRM1 berhubungan erat (P<0,05; P<0,01) dengan setiap parameter kualitas semen. PRM1, PRM2, PRM3, TNP1, dan TNP2 pada tingkat molekuler berperan dalam pengikatan DNA, bekerja pada komponen seluler seperti nukleus, nukleosom, dan kromosom, dan terlibat dalam proses biologi seperti spermatogenesis, kondensasi kromosom, dan pengemasan DNA. Gen PRM1 berasosiasi dengan parameter kualitas semen dan berpotensi sebagai biomarker kualitas dan produksi semen pada pejantan sapi di Indonesia. Penelitian tahap ketiga bertujuan untuk menganalisa protein dari PRM1, PRM2, PRM3 pada spermatozoa dan mengkaji potensinya sebagai marka protein kualitas dan produksi semen. Semen beku yang digunakan dalam penelitian berasal sapi pejantan Limousin, FH, PO masing-masing 6 ekor dan 4 ekor sapi pejantan aceh. Setiap pejantan dikelompokkan menjadi dua kelompok yakni produksi tinggi dan rendah, berdasarkan kapasitas produksi semen beku selama ± 6 bulan. Analisis protein dilakukan menggunakan metode enzyme immunoassay. Korelasi konsentrasi protein dengan parameter kualitas semen pada tahapan ini menggunakan hasil evaluasi karakteristik semen pada tahap 1. PRM1 pada penelitian ini merupakan tipe protamin dengan konsentrasi paling tinggi (P<0,01) dibandingkan dengan tipe protamin lainnya. Konsentrasi PRM1 secara signifikan berbeda (P<0,05) pada kelompok produksi tinggi dan rendah pada pejantan Limousin, FH, PO, dan Aceh. Konsentrasi PRM2 dan PRM3 pada semua rumpun sapi jantan bervariasi satu dengan yang lain, begitu juga dengan hubungannya dengan produksi dan kualitas semen. PRM1 berasosiasi erat dengan setiap parameter kualitas semen (P<0,05; P<0,01). Konsentrasi protein PRM1 merupakan tipe protamin yang paling banyak terkandung pada spermatozoa pejantan Limousin, FH, PO, dan aceh. Protein PRM1 memiliki potensi yang besar sebagai salah satu marka protein penentu kualitas dan produksi semen pada sapi pejantan. Penelitian tahap keempat bertujuan untuk mengkaji penggunaan uji CMA3 untuk mendeteksi defisiensi protamin pada spermatozoa dan hubungannya dengan ketidakstabilan kromatin, serta dampaknya pada berbagai perubahan morfologi kepala spermatozoa. Semen beku yang digunakan dalam penelitian berasal sapi pejantan Limousin, FH, PO masing-masing 6 ekor dan 4 ekor sapi pejantan aceh. Masing-masing rumpun pejantan sapi yang digunakan, diklasifikasikan menjadi dua kelompok, kelompok dengan abnormalitas morfologi kepala spermatozoa tinggi (HD) dan rendah (LD). Hasil pengelompokan ini selanjutnya digunakan untuk pengujian lebih lanjut, seperti kerusakan DNA, defisiensi protamin, dan konsentrasi PRM1. Terdapat 12 jenis abnormalitas kepala spermatozoa yang ditemukan dalam penelitian ini. Kerusakan DNA spermatozoa pada semua rumpun pejantan sapi menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) antara pejantan HD dan pejantan LD. Konsentrasi PRM1 secara signifikan (P<0,05) lebih rendah pada pejantan HD. Defisiensi protamin spermatozoa secara signifikan (P<0,05) lebih tinggi pada pejantan HD dibandingkan pejantan LD. Defisiensi protamin spermatozoa memiliki hubungan yang erat (P<0,01) dengan abnormalitas morfologi kepala spermatozoa, kerusakan DNA, dan konsentrasi PRM1. Uji CMA3 terbukti dapat digunakan sebagai uji alternatif untuk mengetahui spermatozoa dengan defisiensi protamin pada pejantan sapi di Indonesia. Defisiensi protamin pada spermatozoa mempengaruhi stabilitas kromatin spermatozoa dan berdampak pada berbagai perubahan morfologi kepala spermatozoa.

Semen quality parameters routinely evaluated as the basis for determining bull fertility, such as concentration, morphology, and spermatozoa motility, are insufficient to predict bull fertility. The use of genes and proteins in spermatozoa and seminal plasma combined with semen quality testing as a biomarker has been widely reported and is considered more effective. Protamine (PRM) is the main protein in the spermatozoa nucleus that functions in the optimal packaging of DNA. There is an increase in chromatin condensation, which will protect the genetic integrity of the paternal genome. Decreased PRM expression is closely related to infertility with various decreases in semen quality such as concentration, motility, increased morphological abnormalities, and DNA damage of spermatozoa. Transition proteins (TNPs) are proteins found in the nucleus of spermatozoa consisting of TNP1 and TNP2. TNP 2 functions in turning off the transcription process from histones, which then TNP 1 will play a role in stimulating DNA repair that is interrupted during histone removal. Deactivation of the TNPs gene in humans has decreased fertility, characterized by decreased spermatozoa concentration, motility, viability, increased DNA chromatin damage, and various morphological abnormalities. The first phase of the study comprehensively analyzes the quality characteristics of frozen semen in various breeds of bulls in Indonesia. The frozen semen used in the study were from six bulls of each Limousin, FH, and PO and four Aceh bulls. Spermatozoa motility analysis (progressive motility, total motility, non-motile) using computer-assisted semen analysis (CASA). Spermatozoa viability was analyzed using eosin-nigrosine staining. The integrity of the plasma membrane of spermatozoa was analyzed using a HOS solution. Spermatozoa morphological abnormalities were analyzed using the carbolfuchsin-eosin staining method. Acrosome integrity was analyzed using the FITC-PNA staining method. Mitochondrial membrane activity of spermatozoa was analyzed using JC-1. DNA damage evaluation was carried out using Acridine Orange (AO) and Bos halomax staining. Semen quality characteristics on all parameters were significantly different (P<0.05) between bull breeds, except for secondary abnormalities (P>0.05). Spermatozoa mitochondrial membranes were correlated considerably (P<0.01; P<0.01) with progressive motility, total motility, and non-motile. The characteristics of semen quality between bull breeds varied from one another, although overall, the semen quality for each parameter was still considered normal and suitable for Artificial Insemination (AI). The second phase of the study aimed to analyze the relative expression of PRM1, PRM2, PRM3, TNP1, and TNP2 genes in the spermatozoa of bulls used for the AI program in Indonesia and to analyze its potential as biomarkers of semen quality and production. The frozen semen used in the study were from six bulls of each Limousin, FH, and PO and four Aceh bulls. Every bull was grouped into high and low production, based on the frozen semen production capacity for ± six months. Analysis of the expression of PRM1, PRM2, PRM3, TNP1, TNP2, and PPIA genes in frozen semen was performed using RT-PCR. The semen quality parameters used in this study included progressive motility, viability, plasma membrane integrity, acrosome, mitochondrial membrane, head defects, and DNA damage. The relative expression of the PRM1 gene was significantly higher (P<0.05) than the PRM2, PRM3, TNP1, and TNP2 genes in all breeds. PRM1, TNP1, and TNP2 genes were significantly higher (P<0.05) in the high production group than in the low production group. The TNP1 and TNP2 genes were significantly correlated (P<0.05; P<0.01) with progressive motility, spermatozoa head abnormalities, and DNA damage. PRM1 was associated considerably (P<0.05; P<0.01) with each semen quality parameter. PRM1, PRM2, PRM3, TNP1, and TNP2 play a role in DNA binding at the molecular level, act on cellular components such as the nucleus, nucleosomes, and chromosomes, and are involved in biological processes such as spermatogenesis, chromosomal condensation, and DNA packaging. The PRM1 gene is the gene that has the most potential as a biomarker of semen quality and production in bulls in Indonesia. The third stage of the study aimed to analyze the protein of PRM1, PRM2, PRM3 in spermatozoa and assess its potential as a protein marker of semen quality and production. The frozen semen used in the study were from six bulls of each Limousin, FH, and PO and four Aceh bulls. Every bull was grouped into high and low production, based on the frozen semen production capacity for ± six months. Protein analysis of PRM was carried out using the EIA method. The semen quality parameters used in this study included progressive motility, viability, plasma membrane integrity, acrosome, mitochondrial membrane, head defects, and DNA damage. PRM1 in this study was the type of PRM with the highest concentration (P<0.01) compared to other kinds of PRM. The concentration of PRM1 was significantly different (P<0.05) in the high and low production groups in all breeds (P>0.05). PRM2 and PRM3 in all breeds varied from one another and its relationship to semen production and quality. PRM1 was significantly positively correlated with each semen quality parameter (P<0.05; P<0.01). PRM1 is the most abundant type of PRM contained in the spermatozoa of Limousin, FH, PO, and Aceh bulls. PRM1 has excellent potential as a protein marker that determines the quality and production of semen in bulls. The fourth phase of the study aimed to examine the use of the CMA3 to detect protamine deficiency and its relationship to chromatin instability and its impact on various head defects. The frozen semen used in the study were from six bulls of each Limousin, FH, and PO and four Aceh bulls. Every breed of bulls was classified into two groups: high (HD) and low (LD) spermatozoa head morphological abnormalities. These grouping results were then used for further testing, such as DNA damage, protamine deficiency, and PRM1 concentration. There were 12 types of spermatozoa head abnormalities found in this study. Spermatozoa head morphological abnormalities in the HD group were significantly (P<0.05) higher than those in the LD group. Spermatozoa DNA damage in all breeds of bulls showed a significant difference (P<0.05) between HD and LD bulls. PRM1 concentrations decreased significantly (P<0.05) in HD bulls. Protamine deficiency was significantly (P<0.05) higher in HD than in LD bulls. Protamine deficiency was correlated considerably (P<0.01) with abnormal spermatozoa head morphology, DNA damage, and PRM1 concentration. The CMA3 test can be used as an alternative test to identify spermatozoa with protamine deficiency. Protamine deficiency affects the stability of the chromatin and impacts various changes in the morphology of the sperm head.