Perbaikan Tinggi Tanaman Padi IPB3S dan PR135 dengan Aplikasi Penyuntingan Genom CRISPR Cas9/GA20ox2

Abstract

IPB3S adalah padi sawah unggul Indonesia, dan PR135 adalah padi rawa lokal Indoneisa. Keduanya memiliki produktivitas tinggi dan tengah dikembangkan. Namun, keragaannya yang tinggi menyebabkan kedua genotipe ini mudah rebah dan dapat mengurangi hasil panen. Penelitian ini bertujuan untuk menyunting gen GA20ox2 melalui transformasi genetik konstruk CRISPR/Cas9 GA20ox2 ke dalam genom padi IPB3S dan PR135 untuk mengembangkan mutan-mutan padi semi-kerdil. Eksplan embrio muda dari masing-masing genotipe digunakan sebagai eksplan transformasi genetik yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 membawa vektor ekspresi pC1300-Cas9/ GA20ox2 serta dengan mengubah komposisi media regenerasi yang digunakan. Mutan yang diperoleh diaklimatisasi dan dievaluasi secara molekuler dengan teknik PCR untuk mendeteksi keberadaan gen penanda hpt pada daerah T-DNA serta teknik perunutan DNA untuk mengetahui mutasi yang terjadi pada daerah target gen GA20ox2. Persentase pertumbuhan yang diperoleh pada genotipe IPB3S dan PR135 berturut-turut 47,9% dan 51,8%, sedangkan persentase transformasi yang diperoleh pada genotipe IPB3S dan PR135 berturut-turut 19,3% dan 47,8%. Media terbaik untuk regenerasi genotipe IPB3S adalah media A (persentase regenerasi sebesar 73,3%) sedangkan pada PR135 adalah media C (persentase regenerasi sebesar 46,7%). Analisis molekuler berbasis PCR untuk mengidentifikasi integrasi gen hpt menunjukkan bahwa pada genotipe IPB3S diperoleh 24 tanaman mutan T0, sedangkan pada genotipe PR135 diperoleh 102 tanaman mutan T0. Pengamatan lebih lanjut dilakukan dengan memilih tanaman T0 potensial untuk dievaluasi pada generasi T1 dengan mengukur karakter agronomi yang meliputi tinggi tanaman, jumlah anakan, panjang aksersi, panjang malai, jumlah gabah dan bobot 100 butir. Tinggi tanaman merupakan karakter penting yang berkaitan langsung terhadap kemampuan tanaman untuk beradaptasi dengan lingkungan dan potensi hasil. Upaya perbaikan sifat-sifat penting tanaman dapat dilakukan dengan penyuntingan genom. Penyuntingan genom merupakan suatu teknologi yang memanfaatkan aktivitas enzim nuklease buatan untuk menginduksi mutasi pada genom target. Pada tahapan kedua penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi perubahan fenotipe mutan pada generasi T1 di rumah kaca dan mengidentifikasi perubahan susunan basa nitrogen melalui analisis molekuler berbasis PCR dan perunutan DNA. Benih tanaman generasi T0 dengan keragaan lebih pendek dibandingkan tipe liar dan transforman negatif serta membawa gen hpt dievaluasi lebih lanjut pada generasi T1. Dua pasang primer GA20 yang mengamplifikasi sekuen DNA target digunakan untuk analisis perunutan DNA. Individu yang diamati pada generasi T1 sebanyak 200 individu. Pengamatan pada karakter tinggi tanaman menunjukan sebanyak 5 individu IPB3S dan 16 individu PR135 mengalami penurunan tinggi tanaman dan diikuti perubahan pada karakter lainnya seperti panjang batang, jumlah anakan, jumlah internodus, panjang aksersi, panjang malai, jumlah gabah dan bobot 100 butir. Analisis perunutan DNA dengan primer GA20 yang mengapit sekuen gen GA20ox2 pada ekson 1 berhasil mengamplifikasi sebanyak 2 individu IPB3S dan 9 individu PR135. Hasil analisis perunutan DNA dengan software Genious 10.0.3 menunjukan mutasi yang terjadi pada sekuen gen target (gRNA 1 dan gRNA2) berupa mutasi subtitusi, insersi dan delesi. Mutasi terbesar dialami oleh mutan genotipe IPB 14-10 (69,7%; meliputi 9 insersi basa, 9 delesi basa, dan 43 subtitusi basa), diikuti oleh genotipe PR 3I-21 (48,3%; 10 insersi basa, dan 33 subtitusi basa) dan PR 53-2 (41,6%; 14 delesi basa dan 20 subtitusi basa). Mutasi subtitusi merupakan mutasi yang paling banyak banyak pada kedua genotipe yang diamati apabila dibandingkan dengan mutasi insersi maupun delesi, yaitu sebesar 102 subtitusi basa pada PR135 dan 57 subtitusi basa pada IPB3S.

IPB3S is Indonesia's superior lowland rice cultivars while PR135 is Indonesia’s local swamp rice. They are being developed and have high productivity. However, they are prone to lodging and could reduce the yield because of their high posture. This study aimed to edit the GA20ox2 gene through the introduction of CRISPR/Cas9 GA20ox2 construct into IPB3S and PR135 genotypes to develop semi-dwarf mutans. Immature embryo explants of IPB3S and PR135 genotypes were used for the transformation process mediated by Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 carrying pC1300-Cas9/GA20ox2 by changing the regeneration media composition. The putative mutant lines acclimatized and molecularly evaluated by PCR for the presence of hpt selectable marker in the gene target. Growth efficiency obtained in IPB3S and PR135 genotypes were 47,9% and 51,8%, while transformation efficiency obtained in IPB3S and PR135 genotypes were 19,3% and 47,8%, respectively. Modification of regeneration media has succeeded in obtaining plantlets IPB3S and PR135 genotypes 37 and 151 plantlets, respectively. The best media for the regeneration of IPB3S and PR135 genotypes were A medium (regeneration efficiency of 73,3%) and C medium (regeneration efficiency of 46,7%), respectively. PCR-based molecular analysis to detect the hpt gene integration in T0 lines showed that there were 24 individuals of IPB3S and 102 individuals of PR135 genotypes. Further observations were carried out by measuring the agronomic characters of potential T0 lines which included plant height, number of tillers, accession lenght, panicle length, total grain and 100 grains-weight. Plant height is an important character that is directly related to the ability of plants to adapt to the environment and to produce high yield potential. The efforts to improve essential plant traits could be made by genome editing. Genome editing is a technology that utilizes the artificial nuclease enzyme activity to induce mutations in the genome target. This study aims to identify the mutant phenotype changes in the T1 lines through PCR-based and DNA sequencing. Seeds of T0 lines that were positive carrying the hpt marker gene were used to obtain T1 lines. A total of 10 plant numbers transformed from the T0 lines, each negative transformant of IPB3S and PR135, and each wild type of IPB3S and PR135 were used as control. Two pairs of GA20 primers amplifying target DNA sequences were used for DNA sequencing analysis. We observed 200 individuals in T1 lines. Observations on plant height characters showed that as many as 5 IPB3S and 16 PR135 individuals experienced a decrease in plant height and followed by changes in other characters such as stem length, number of tillers, number of internodes, accession length, panicle length, total grains and 100 grain-weight compared to tipe liar and negative transformant. DNA sequencing analysis by GA20 primers that flanked the exon 1 of the GA20ox2 gene sequence successfully amplified 2 individuals of IPB3S and 7 individuals of PR135. The results of the analysis using Genious 10.0.3 software showed that mutations that occur in the target gene sequences (gRNA1 and gRNA2) were substitution, insertion and deletion. The largest mutations were experienced by genotype IPB 14-10 mutants (69,7%; including 9 base insertions, 9 base deletions, and 43 base substitutions), followed by the PR 3I-21 genotype (48,3%; 10 base insertions, and 33 base substitutions) and PR 53-2 (41,6%; 14 base deletions and 20 base substitutions). Substitution mutations were the most common mutations in both genotypes observed when compared to insertion and deletion mutations, namely 102 base substitutions at PR135 and 57 base substitutions in IPB3S.