Desain sgRNA untuk Pengeditan Gen DLT dengan CRISPR- Cas9 dan Prediksi Mutasi secara in silico pada Padi varietas Hawara Bunar

Abstract

ABSTRAK IBNU HALIM. Desain sgRNA untuk Pengeditan Gen DLT dengan CRISPR- Cas9 dan Prediksi Mutasi secara in silico pada Padi varietas Hawara Bunar. Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan MIFTAHUL HUDA FENDIYANTO.

Peningkatan hasil padi yang tinggi adalah tujuan utama dalam memenuhi kebutuhan beras yang meningkat seiring meningkatnya jumlah penduduk. Peningkatan hasil padi dapat dicapai dengan memperbaiki karakter morfo-agronomi termasuk tinggi tanaman dan jumlah anakan. Salah satu pendekatan yang dapat digunakan adalah dengan mengedit gen DWARF and LOW TILLER/DLT melalui teknik CRISPR-Cas9. Gen DLT merupakan faktor transkripsi untuk biosintesis Brassinosteroid/BR. Memanipulasi biosintesis ataupun pensinyalan BR sangat mempengaruhi arsitektur padi. Ketepatan penentuan situs gen target pada teknik CRISPR-Cas9 ditentukan oleh urutan 20-nt dalam sgRNA yang didesain melalui program bioinformatik dan wilayah pengikatan yang dikenal sebagai Protospacer Adjacent Motif (PAM). Untuk itu penelitian ini bertujuan mendesain sgRNA dan memprediksi ketepatan mutasi gen DLT pada padi varietas Hawara Bunar. DNA genom padi diisolasi dengan metode Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB). Amplifikasi gen DLT dengan teknik PCR menggunakan satu pasang primer yang didesain dari gen reference. Hasil PCR disekuen dan sekuen partial gen DLT digunakan untuk mendesain sgRNA menggunakan program chopchop.cbu.uib.no. Oligo sgRNA telah berhasil didesain dengan target domain Gras family protein dari gen DLT padi varietas Hawara Bunar. Mutasi diprediksi akan terjadi pada wilayah domain tersebut yaitu posisi nukleotida 1466573 hingga 1466591, dan pada tingkat struktur sekunder protein perubahan yang terjadi akibat mutasi berawal dari asam amino ke 406 hingga ke posisi C terminal.

Kata kunci: CRISPR-Cas9, gene editing, DLT, sgRNA

ABSTRACT IBNU HALIM. Design of sgRNA to Edit DLT Gene using CRISPR-Cas9 and In Silico Mutation Prediction in Rice var. Hawara Bunar. Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan MIFTAHUL HUDA FENDIYANTO.

Increasing rice yield can be achieved by modifying of plant architecture, including plant height and tiller number. The DWARF AND LOW TILLERRING (DLT) gene is a transcription factor for a gene involved in Brassinosteroid (BR) biosynthesis. Manipulating BR biosynthesis will strongly influence rice architecture. CRISPR-Cas9 is an accurate tool to edit a gene sequence. The accuracy of site determination of CRISPR-Cas9-mediated target gene is determined by the 20-nt sequence in the sgRNA and the binding site known as the Protospacer Adjacent Motif (PAM). For this reason, the study aimed to design sgRNA and predict the accuracy of DLT gene mutation sites in rice var. Hawara Bunar cultivar. Mutation prediction begins with the isolation of rice genomic DNA using the Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) method, followed by amplification of the exon 1 DLT gene using a primer pair designed from the reference gene. The PCR product was then sequenced, and then use the sequence to design sgRNA. The study has designed sgRNA located on the targeted sequence that corresponding to the Gras family protein domain of the exon1 DLT gene. The mutation sites were predicted to be at the domain site through the parallel alignment of the nucleotide and amino acid sequences of the DLT gene and the reference gene. It is predicted that mutation in nucleotide sequence of the target site corresponding to the protein domain will change the protein structure and its function.

Keywords: Bioinformatics, CRISPR-Cas9, DLT, sgRNA