Pengembangan Demineralized Freeze-Dried Bone Xenograft dan Allograft untuk Penanganan Defek Tulang pada Kucing

Abstract

Fraktur merupakan salah satu bentuk gangguan muskuloskeletal yang paling banyak ditemukan pada hewan kesayangan. Namun data valid mengenai prevalensi kejadian fraktur pada anjing dan kucing di Indonesia belum tersedia. Salah satu tipe fraktur yang sulit ditangani adalah comminuted fracture, dimana tulang patah menjadi lebih dari dua segmen dan sering kali menimbulkan komplikasi (infeksi sekunder) akibat adanya bagian tulang yang hilang. Fraktur dengan derajat keparahan comminuted tidak sepenuhnya dapat diselesaikan dengan pemasangan bone pin, screw dan wire. Bone graft sering kali dibutuhkan dalam menangani kasus tersebut. Namun ketersediaan material bone graft terbatas di Indonesia, dan masih didominasi oleh produk luar negeri (import). Penelitian ini bertujuan untuk mencari tahu prevalensi kejadian fraktur pada hewan kesayangan di Indonesia, dalam hal ini khususnya wilayah Bogor. Selain itu, penelitian ini juga bertujuan untuk memproduksi material bone graft yang dapat digunakan untuk hewan kesayangan dengan biokompatibilitas yang baik. Studi retrospektif dilakukan selama 11 tahun pada periode 2008-2018 di Rumah Sakit Hewan Pendidikan Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (RSHP FKH IPB). Proses sintesis dan sterilisasi produk demineralized freezedried bone xenograft (DFDBX) dan allograft (DFDBA) dilaksanakan di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (PAIR BATAN). Proses karakterisasi produk dilakukan di Pusat Sains dan Teknologi Bahan Maju (PSTBM) BATAN. Pengujian in vitro dilakukan menggunakan sel calf pulmonary artery endothelial (CPAE) dengan MTT assay di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) IPB. Pengujian in vivo material DFDBX dilakukan di RSHP FKH IPB. Berdasarkan studi retrospektif yang dilakukan pada sebelas tahun terakhir (2008-2018), terlihat bahwa kejadian fraktur di wilayah Bogor didominasi oleh kucing (61%) dan anjing (30%), disusul oleh hewan eksotis (8%) dan ternak (1%). Predisposisi fraktur pada hewan kesayangan adalah hewan jantan berusia <1 tahun, dan etiologi terbanyak yang diketahui adalah kecelakaan lalu lintas. Sebagian besar fraktur terjadi pada tulang ekstremitas seperti os femur, os tibiafibula, dan os radius-ulna. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa berdasarkan derajat keparahannya, tipe comminuted banyak terjadi pada kucing, sementara tipe completed lebih banyak terjadi pada anjing. Pengembangan material DFDBX dan DFDBA ini diharapkan tidak hanya menjadi solusi pada kasus comminuted fracture, namun juga pada kondisi defek tulang lainnya. Pada penelitian ini, material DFDBX berasal dari tulang sapi, sementara material DFDBA berasal dari donor tulang (kadaver) kucing. Penelitian ini menghasilkan enam varian DFDBX dan enam belas varian DFDBA, yang dibuat berdasarkan kombinasi jenis tulang (cancellous dan cortical), ukuran filter (20, 40, dan 60 mesh), serta dosis iradiasi yang berbeda (15 dan 25 kGy). Varian DFDBA diperbanyak untuk mengoptimalkan jumlah bahan baku yang tersedia. Beradasarkan pengujian in vitro, terlihat bahwa kombinasi material yang paling baik dalam preservasi sel hidup dengan toksisitas yang rendah adalah DFDBA dengan ukuran partikel <20 mesh (>1000 µm) yang berasal dari tulang cortical baik dengan dosis iradiasi 15 kGy maupun 25 kGy. Hasil tersebut bertentangan dengan hasil penelitian terdahulu yang dilakukan untuk kepentingan ortopedi dan dental manusia, yang menyatakan bahwa material DFDBX berukuran 60 mesh merupakan karakter yang ideal. Hal ini mendasari dilakukannya pengujian in vivo, yaitu dengan menguji penambahan serum autograft dan allograft pada aplikasi material DFDBX berukuran 20, 40, dan 60 mesh yang diiradiasi dengan dosis 15 kGy. Pengujian pada tahap ini diharapkan dapat melihat pengaruh penambahan serum dan jenis serum yang paling baik untuk mendukung persembuhan jaringan dan menurunkan respon penolakan dari tubuh resipien. Berdasarkan hasil analisis darah, terlihat bahwa implantasi DFDBX tidak memberikan dampak negatif terhadap respon biologis sistemik dari tubuh hewan coba (tidak bersifat alergenik). Penambahan serum autograft dan allograft lebih banyak berpengaruh (secara postif) pada parameter sel darah merah seperti eritrosit, Hb, hematokrit, dan MCV. Perubahan terutama terlihat pada kelompok 60 mesh dimana profil darahnya jauh lebih stabil (dalam kisaran nilai normal) jika ditambahkan dengan serum dibandingkan dengan aplikasi materialnya saja. Sementara parameter sel darah putih secara signfikan lebih banyak dipengaruhi oleh faktor waktu. Pada penelitian ini, respon peradangan terjadi secara fisiologis karena hampir semua parameter sel darah putih kembali pada kisaran normal pada hari ke 14 dan 30 pasca operasi. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa material DFDBX yang diproduksi memiliki kompatibilitas yang baik secara in vivo, meskipun material DFDBA lebih unggul pada pengujian in vitro. Pengujian lebih lanjut dapat dilakukan untuk meningkatkan performa material DFDBX dan DFDBA dan pengujian klinis pada kucing untuk melihat respon tubuh dari target spesies.

A fracture is one of the musculoskeletal disorder that commonly found in pets. However, valid data regarding the prevalence of fracture incidence in dogs and cats in Indonesia are not available yet. One type of fracture that is difficult to treat is the comminuted fracture, where the bone breaks into more than two segments and often results in complications (secondary infection) due to the missing part of the bone. The comminuted fracture can not completely resolve by placing bone pins, screws and wires. The bone graft material is often needed in this case. However, the availability of bone graft is limited in Indonesia and still dominated by imported products. This study aimed to find out the fracture prevalency in Indonesian pets, especially in Bogor. This study also aimed to produce bone graft material with good biocompatibility for pets. This retrospective study conducted for 11 years in the 2008-2018 period at the Veterinary Teaching Hospital of the Faculty of Veterinary Medicine, Bogor Agricultural University (RSHP FKH IPB). The synthesis and sterilization of demineralized freeze-dried bone xenograft (DFDBX) and allograft (DFDBA) products conducted at the National Nuclear Energy Agency's Isotope and Radiation Application Center (PAIR BATAN). The product characterization process carried out at the Center for Advanced Materials Science and Technology (PSTBM) BATAN. The in vitro testing was carried out using calf pulmonary artery endothelial (CPAE) cells with MTT assay at the Primate Research Center (PSSP) IPB. The in vivo testing of DFDBX material was carried out at the RSHP FKH IPB. Based on a retrospective study conducted in the last eleven years (20082018), it can be seen that the incidence of fractures in Bogor was dominated by cats (61%) and dogs (30%), followed by exotic animals (8%) and livestock (1%). The predisposition of fracture in pets is male animals aged <1 year, with traffic accidents as the most known etiology. Most of the fractures occur in the extremities bones such as the femur, tibial-fibular, and radial-ulnar bones. This study also showed that based on the degree of severity, the comminuted type was more common in cats, while the completed type was more common in dogs. The development of demineralized freeze-dried bone xenograft (DFDBX) and allograft (DFDBA) material were expected not only to be a solution in comminuted fracture cases but also in other bone defect conditions. In this study, the DFDBX material came from bovine bones, while the DFDBA material came from a feline bone (cadaver) donor. This study resulted in six variants of DFDBX and sixteen variants of DFDBA, which were made based on a combination of bone types (cancellous and cortical), filter sizes (20, 40, and 60 mesh), and different irradiation doses (15 and 25 kGy). The DFDBA variant reproduced to optimize the number of raw materials available. Based on in vitro testing, it appears that the best combination of materials for preserving living cells with low toxicity is DFDBA with a particle size of <20 mesh (> 1000 µm) derived from the cortical bone with either 15 kGy or 25 kGy irradiation doses. These results contradict the previous studies conducted for human orthopedic and dental purposes, which stated that the 60 mesh size DFDBX material was an ideal character. These findings underlie the in vivo testing, namely by testing the addition of serum autograft and allograft to the application of DFDBX material measuring 20, 40, and 60 mesh irradiated with 15 kGy. This step of the research was expected to see the effect of adding a serum and the best type of serum to support tissue healing and reduce the rejection response from the recipient's body. Based on the results of blood analysis, it appears that DFDBX implantation does not harm the systemic biological response of the animal's body (nonallergenic). The addition of serum autograft and allograft had more effect (positively) on red blood cell parameters such as erythrocytes, Hb, hematocrit, and MCV. The changes were especially seen in the 60 mesh group where the blood profile was much more stable (within the normal range) than the application of the material alone, without the addition of serum. Meanwhile, the parameters of white blood cells were significantly more influenced by the time factor. In this study, the inflammatory response occurred physiologically because almost all blood parameters returned to normal ranges on days 14 and 30 postoperatively. Based on these results, it can be concluded that the produced DFDBX material has good in vivo compatibility, even though the DFDBA material is superior in in vitro testing. Further testing can be carried out to improve the performance of DFDBX and DFDBA materials and clinical trials in cats to see the body response of target species.