Transformation of Rice Calli with CRISPR-Cas9 Constructs to Edit the Yield-related Genes

Abstract

High yield improvement of rice (Oryza sativa L.) is the main goal in rice breeding and could be achieved by gene editing through CRISPR-Cas9 technique as a revolution technique in genome editing. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated (Cas9) has shown a precise and efficient genome editing tool by inducing random mutation in the cleavage region to knock out genes. The objective of this research is to transform sgRNA-CRISPR-Cas9 constructs to Jao Hom Nin (JHN) rice calli to knock out DL, Gn1a, Roc5, and Tad1 genes, which are the yield-related genes. The sgRNA-CRISPR-Cas9 constructs in pRGEB32 plasmid, were transformed into rice callus through Agrobacterium tumefaciens EHA105. Afterwards, the callus genome was verified using PCR technique to identify the sgRNA insert in the rice genome. Also, transformant calli was tested by T7 Endonuclease I (T7EI) assay to detect the mismatches existence shown by digested bands. Mismatches occur when the DNA repairs itself after Cas9 successfully cuts the target gene’s region and causes insertion and deletion (indels) mutation. The result showed that each callus was successfully transformed by the transformant Agrobacterium tumefaciens with sgRNA-CRISPR-Cas9 construction vector and the sgRNA was successfully inserted to the rice genome. When they are tested using PCR, we obtained amplified edited bands of Tad1, DL, and Roc5 genes, except for Gn1a gene target. T7EI assay had been done successfully, but no mismatched fragments were found.

Peningkatan hasil produksi tanaman padi (Oryza sativa L.) merupakan tujuan utama dari pemuliaan tanaman padi dan dapat dicapai dengan peyuntingan gen melalui teknik CRISPR/Cas9 sebagai sebuah teknik revolusi dalam penyuntingan genom. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)berasosiasi dengan gen Cas9 telah menjadi sebuah alat penyuntingan genom yang akurat dan efisien dengan menginduksi mutasi acak pada wilayah pemotongan untuk mengubah gen target. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan transformasi kalus padi varietas Jao Hom Nin (JHN) dengan konstruksi sgRNACRISPR-Cas9 untuk mengubah gen Tad1, DL, Roc5, dan Gn1a yang merupakan gen-gen terkait hasil produksi pada tanaman padi. Konstruksi sgRNA-CRISPRCas9 dalam plasmid pRGEB32 diintroduksikan ke dalam kalus padi melalui Agrobacterium tumefaciens EHA105. Selanjutnya, genom kalus tersebut diverifikasi dengan teknik PCR untuk mendeteksi keberhasilan sisipan sgRNA pada genom padi. Selain itu keberadaan mutasi pada gen target diuji dengan uji T7 Endonuclease I (T7EI) untuk mendeteksi keberadaan mismatches yang ditujukkan oleh pita-pita DNA terpotong. Mismatches terjadi ketika DNA memperbaiki dirinya setelah Cas9 berhasil memotong wilayah gen target dan menyebabkan mutasi insersi-delesi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa setiap kalus berhasil ditransformasi oleh Agrobacterium tumefaciens dengan pRGEB32 yang membawa konstruksi sgRNA-CRISPR-Cas9 yang ditunjukkan oleh amplikon daerah target gen Tad1, DL, dan Roc5, kecuali Gn1a. Ketika gen target diverifikasi dengan uji T7EI diperoleh amplikon yang sama dengan gen target yang mengindikasikan tidak ditemukan adanya mismatches pada target gen Tad1, DL, dan Roc5.