Aktivitas Enzim NADP(H) Oksidoreduktase dan Produksi Kinin pada Kultur Sel Kina (Cinchona ledgeriana Moens) yang Dielisitasi.

Abstract

Tanaman kina (Cinchona ledgeriana) merupakan tanaman industri penghasil senyawa sekunder alkaloid kinolin. Salah satu senyawa alkaloid kinolin yang sangat potensial adalah kinin. Kinin dapat dimanfaatkan sebagai obat malaria, antioksidan, dan pengaya flavor dalam produk minuman ringan. Kulit batang kina umumnya dipanen untuk diekstrak alkaloidnya. Lamanya budidaya dan waktu panen tanaman, serta lamanya waktu pemulihan tanaman setelah dipanen merupakan beberapa kendala dalam upaya mempertahankan dan meningkatkan produksi kinin secara konvensional. Untuk mengatasi masalah tersebut, peningkatan produksi kinin dengan sistem kultur in vitro melalui metode kultur sel diharapkan menjadi solusi. Kultur sel tergolong efisien baik dari segi bahan baku maupun waktu, tidak bergantung iklim dan musim, serta produksi dapat ditingkatkan secara berkelanjutan. Metode kultur sel biasanya dilakukan dengan elisitasi, yaitu suatu teknik untuk menciptakan kondisi stres (cekaman) yang menyebabkan perubahan fisiologi dan biokimia sehingga meningkatkan produksi senyawa sekunder. Elisitasi dilakukan dengan menambahkan senyawa yang dinamakan elisitor. Apabila penggunaan elisitor dapat meningkatkan produksi suatu metabolit sekunder, maka aktivitas enzim-enzim pada lintasan biosintesis metabolit sekunder tersebut diduga juga meningkat. Untuk kinin, hal ini menimbulkan pertanyaan tentang enzim mana pada lintasan biosintesis kinin yang nyata terelisitasi oleh perlakuan yang diberikan. Sejauh ini, informasi mengenai enzim yang berperan dalam pembentukan alkaloid kinolin, khususnya kinin masih sangat terbatas. Diketahui bahwa enzim yang terdekat dalam jalur biosintesis kinin adalah NADP(H) oksidoreduktase. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas NADP(H) oksidoreduktase pada kultur sel kina yang dielisitasi dan mengetahui keterkaitan aktivitas enzim tersebut dengan produksi alkaloid kinin. Penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahapan. Tahap pertama merupakan tahap kultur suspensi sel. Tahap kedua, dilakukan ekstraksi dan fraksinasi senyawa alkaloid dari hasil kultur yang dielisitasi, kemudian dianalisis melalui HPLC, untuk mengetahui konsentrasi kinin dalam sel. Tahap ketiga merupakan uji aktivitas enzim. Pada tahap ini, dilakukan ekstraksi serta pengukuran kadar protein kasar, dan dilanjutkan dengan pengujian aktivitas enzim dengan substrat kinin dan koenzim NADP dengan metode fluorometri. Kultur sel kina dielisitasi menggunakan asam absisat (ABA) dan paklobutrazol (PBZ) yang dikombinasikan dengan susbtitusi gula alkohol berupa sorbitol dan manitol. Perlakuan terdiri dari lima kombinasi, yaitu: (1) K (tanpa elisitor), (2) A3K (ABA 3 mg/L + sukrosa 30 g/L); (3) A3S (ABA 3 mg/L + sorbitol 5.3 g/L + sukrosa 20 g/L); (4) P7M (PBZ 7 mg/L + manitol 5.3 g/L + sukrosa 20 g/L); dan (5) P7-3M (PBZ 7 mg/L yang dimasukkan pada minggu ketiga kultur + manitol 5.3 g/L + sukrosa 20 g/L). Sel dipanen setelah berumur 7 minggu dan dianalisis pertumbuhan, biomassa, alkaloid kinin, dan aktivitas enzim NADP(H) oksidoreduktase hasil kultur yang dielisitasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan sel terbaik pada minggu ke-7 diperoleh pada kultur dengan media yang tidak diberi elisitor (kontrol). Pertumbuhan dan biomassa terbaik untuk kultur dengan media yang mengandung elisitor, terdapat pada perlakuan A3S dan A3K, sedangkan kultur dengan media yang ditambah PBZ, baik perlakuan P7M dan P7-3M menghasilkan pertumbuhan dan biomassa sel terendah. Aktivitas enzim biosintesis alkaloid kinolin, NADP(H) oksidoreduktase, terdeteksi pada kontrol dan semua perlakuan elisitasi. Penambahan elisitor pada kultur berpengaruh dalam meningkatkan aktivitas enzim. Aktivitas enzim tertinggi terdapat pada perlakuan P7M (165.42 μM/mg protein) dan A3S (156.37 μM/mg protein) yang bersesuaian dengan akumulasi/produksi senyawa alkaloid kinin tertinggi (100.95 μg/g dan 23.12 μg/g). Aktivitas enzim terendah terdapat pada kultur yang tidak diberi elisitor/kontrol (143.13 μM/mg protein). Aktivitas NADP(H) oksidoreduktase diketahui meningkat pada semua perlakuan yang dielisitasi dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan aktivitas enzim tertinggi terdapat pada perlakuan P7M dan A3S yaitu sebesar 13.5 % dan 8.5 %.