Respon Genotipe dan Induksi Ketahanan Phalaenopsis terhadap Patogen Busuk Lunak (Dickeya dadantii)

Abstract

Phalaenopsis merupakan salah satu genus anggrek yang terkenal dengan keragaman warna, bentuk, dan ukuran bunga yang tinggi. Hibridisasi Phalaenopsis telah dikembangkan secara intensif, menghasilkan > 100.000 varietas secara global. Tanaman dari genus ini digunakan sebagai tanaman hias pot karena keragaman varietas dan umur bunga yang panjang. Salah satu masalah paling kritis dalam budidaya Phalaenopsis adalah penyakit busuk lunak (SRD). Infeksi SRD muncul pada daun berupa bercak kecoklatan, busuk, dan tembus cahaya. SRD mungkin disebabkan oleh patogen dari genus Enterobacter. Identifikasi spesies yang dapat menjadi sumber ketahanan terhadap SRD dan pemahaman mekanisme yang terlibat merupakan langkah penting untuk efisiensi dalam pemuliaan Phalaenopsis. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi spesies Phalaenopsis yang mungkin menunjukkan ketahanan terhadap patogen SRD dan mekanisme ketahanannya. Spesies yang tahan dapat digunakan lebih lanjut untuk tetua dalam persilangan Phalaenopsis. Pemahaman tentang mekanisme ketahanan di tingkat biokimia dan molekuler akan memberikan informasi dasar dalam pengembangan ketahanan tanaman terhadap SRD. Penelitian ini terdiri dari dua bagian. Pertama, karakterisasi molekuler patogen SRD dengan sekuensing gen marker 16S rRNA, karakterisasi fisik dan anatomi beberapa karakter daun spesies Phalaenopsis, dan pengujian respon ketahanan delapan spesies Phalaenopsis terhadap patogen busuk lunak. Isolat bakteri yang digunakan dalam percobaan ini dipastikan adalah Dickeya dadantii dengan 98.37% identitasnya sesuai dengan Erwinia spp. di NCBI. Hasil pengamatan karakteristik daun menunjukan ketebalan daun dan kadar air tidak berbeda, tetapi kerapatan stomata berbeda nyata diantara spesies yang diuji. P. bellina menunjukkan kepadatan stomata tertinggi di antara spesies yang diamati. Pengujian respon ketahanan spesies Phalaenopsis terhadap D. dadantii menggunakan metode detached leaf. Diameter gejala busuk lunak diamati pada jam 6, 12, dan 18 jam pasca inokulasi (JSI). Keparahan penyakit (KP) dan progres perkembangan penyakit (AUDPC) dihitung dari diameter gejala SRD. Populasi bakteri (CFU) dihitung menggunakan sampel daun di sekitar gejala busuk lunak pada 18 JSI. Hasil penelitian menunjukkan bahwa spesies yang paling tahan adalah P. amboinensis pada 18 JSI dengan KP sebesar 28% dibandingkan spesies lain yang menunjukkan KP ≥50%. Jenis yang paling rentan adalah P. amabilis, P. fimbriata, dan P. cornu-cervi. Jumlah CFU dan AUPDC pada P. amboinensis lebih rendah (5x104 CFUmg-1) dibandingkan pada spesies lain (≥3x105 CFUmg-1). Aktifitas pathogen-related enzymes meliputi Fenilalanin amonia-lyase (PAL) dan peroksidase (PRX) diamati pada dua waktu yang berbeda. Pengamatan pada 12 JSI menunjukkan bahwa P. pantherina dan P. amboinensis memiliki PAL (masing-masing 0.95 dan 1.20 u min-1mg protein-1 x 104) dan PRX (masing-masing 0.77 dan 0.21 u min-1mg protein-1 x 104). Aktivitas PAL (masing-masing 13.75 dan 13.41 u min-1mg protein-1 x 104) dan PRX (masing-masing 7.25 dan 8.73 u min-1mg protein-1 x 104) lebih rendah pada P. schilleriana dan P. amabilis. Tren serupa juga ditemukan pada 16 JSI. Analisis asam salisilat (SA) menunjukkan akumulasi SA yang lebih rendah pada spesies yang paling tahan (P. amboinensis) dibandingkan dengan spesies yang paling rentan (P. amabilis). Hasil saat ini menunjukkan bahwa mekanisme ketahanan P. amboinensis mungkin tidak bergantung pada jalur PAL, PRX dan SA. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi temuan ini. Bagian kedua penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi respon ketahanan genotipe Phalaenopsis terhadap D. dadantii setelah perlakuan SA sebagai penginduksi ketahanan potensial. Bagian ini terdiri dari tiga percobaan. Pada percobaan pertama, delapan genotipe Phalaenopsis diberi perlakuan SA pada dosis 0 (kontrol), dan 60 ppm kemudian diinokulasi dengan D. dadantii. Hasil penelitian menunjukkan bahwa SA pada 60 ppm tidak meningkatkan ketahanan genotipe Phalaenopsis terhadap D. dadantii. Dalam percobaan kedua, perwakilan dari genotipe yang sangat rentan (P. amabilis) diaplikasikan SA dengan konsentrasi yang lebih tinggi (360 dan 720 ppm). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi SA 360 dan 720 ppm ketahanan P. amabilis menjadi sedikit meningkat. Pada percobaan ketiga, konsentrasi SA yang paling efektif dari percobaan sebelumnya (720 ppm), diterapkan pada hari ke-2, 3, 5, dan 7 sebelum inokulasi D. dadantii. Waktu pengaplikasian SA tidak berpengaruh terhadap ketahanan P. amabilis terhadap D. dadantii. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi SA hingga 60 ppm tidak menghambat infeksi D. dadantii, namun, perkembangan gejala yang lebih lambat diamati pada dosis SA yang lebih tinggi (720 ppm) dan p dalam waktu yang singkat. Penelitian ini menginformasikan spesies potensial sebagai sumber sifat ketahanan terhadap D. dadantii. Analisis biokimia menunjukkan pengecualian peran PAL, PRX, dan SA dalam ketahanan Phalaenopsis terhadap D. dadantii.

Phalaenopsis is one of the popular orchid genera with a high variety of flower colors, shapes, and sizes. The development of Phalaenopsis hybrids has been advanced intensively, producing >100,000 varieties globally. Plants of this genera are the most spread ornamental pot plant because of the diverse varieties and long vase life of the flowers. Unfortunately, one of the most critical problems for the cultivation of Phalaenopsis is a soft-rot disease (SRD). The SRD infection presents in leaves as a brownish, water-soaked, translucent spot. The SRD may be caused by Enterobacter pathogens. Identification of species that can serve as a source of SRD resistance and understanding the mechanisms involved are important steps towards improved of Phalaenopsis breeding. This research aims to identify Phalaenopsis species that may exhibit resistance to the SRD pathogen and its resistance mechanisms. The resistance species could be further applied for parents in Phalaenopsis crossing. Understanding the resistance mechanism in biochemical and molecular levels will give basic information in developing plant resistance to SRD. This research consisted of two parts. Firstly, the molecular characterization of the SRD pathogen using 16S rRNA marker gene sequencing, physical and anatomical characterization for several characters of Phalaenopsis species, and testing the responses of eight species of Phalaenopsis against the soft-rot pathogen. The bacterial isolates used in this experiment were confirmed to be Dickeya dadantii with 98.37% of sequence identity match to Erwinia spp. on NCBI. Leaf characteristics observation showed no difference in leaf thickness and water content but significantly different in stomatal density. P. bellina showed the highest stomata density among the species observed. The Phalaenopsis species responses to D. dadantii was tested by using the detached leaf inoculation method. The diameter of the soft-rot symptoms was observed at 6, 12, and 18 hours post-inoculation (HPI). The disease severity (DS) and the area under the disease progress curve (AUDPC) were calculated from SRD symptom diameter. The colony-forming units (CFU) were counted using leaf samples around soft-rot symptom at 18 HPI. The results indicated that the most potential resistance species was P. amboinensis at 18 HPI showed 28% DS compared to another species which showed ≥50% DS. The most susceptible species were P. amabilis, P. fimbriata, and P. cornu-cervi. The number of CFU and AUPDC in P. amboinensis were lower (5x104 CFUmg-1) than that in the other species (≥3x105 CFUmg-1). Pathogen-related enzymes Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and peroxidase (PRX) were observed at two different times. Observation at 12 HPI showed that P. pantherina and P. amboinensis had PAL (0.95 and 1.20 u min-1mg protein-1 x 104, respectively) and PRX (0.77 and 0.21 u min-1mg protein-1 x 104, respectively). These activities were lower than P. schilleriana and P. amabilis PAL (13.75 and 13.41 u min-1mg protein-1 x 104, respectively) and PRX (7.25 and 8.73 u min-1mg protein-1 x 104, respectively). A similar trend was also found at 16 HPI. Salicylic acid content analysis demonstrated a lower salicylic acid (SA) accumulation in the most resistant species (P. amboinensis) than in the most susceptible (P. amabilis). The present results suggest the resistance mechanism of P. amboinensis may be independent of the PAL, PRX, and SA pathways. However, more studies are needed to confirm this finding. The second part of this study aims to evaluate the genotypes response to D. dadantii after SA treatment as the potential resistance inducer. This chapter consists of three experiments. In the first experiment, eight Phalaenopsis genotypes were treated with SA at doses of 0 (control), and 60 ppm then inoculated with D. dadantii. The results showed that SA at 60 ppm did not increase the genotypes resistance D. dadantii. In experiment two, a representative of a very susceptible genotype (P. amabilis) was treated with higher SA concentrations (360 and 720 ppm). The results demonstrated that at SA concentrations of 360 and 720 ppm the resistance of P. amabilis was slightly increased to D. dadantii. In experiment three, we used the most effective SA concentration from the previous experiment (720 ppm), applied at 2, 3, 5, and 7 days before D. dadantii inoculation. The time of SA application did not affect the resistance of P. amabilis to D. dadantii. This suggests that SA concentrations up to 60 ppm did not inhibit D. dadantii infection, yet, such inhibition was observed at higher SA doses (720 ppm) and least in a short period. This present research informed the potential species as a source of resistance trait to D. dadantii. Biochemical analysis indicated the exclusion of PAL, PRX, and SA role in Phalaenopsis resistance against D. dadantii.