Ekspresi Gen Lipase Asal Micrococcus luteus pada Pichia pastoris

Abstract

Lipase merupakan enzim yang akhir-akhir ini semakin menarik perhatian berbagai sektor industri. Terkenal karena multifasetnya menjadikan lipase sebagai salah satu enzim hidrolitik dengan permintaan cukup tinggi. Hal tersebut mengharuskan peningkatan eksplorasi, identifikasi, dan pengembangan lipase-lipase jenis baru dengan karakteristik yang sesuai dengan kebutuhan industri. Lipase EMP48-D merupakan lipase baru yang berasal dari bakteri lipolitik Micrococcus luteus yang diisolasi dari tempe. Lipase EMP48-D adalah lipase yang aktif pada pH rendah (lipase asidik), toleransi terhadap suhu tinggi, dan stabil diberbagai pelarut organik. Karakteristik tersebut membuat lipase EMP48-D berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat diaplikasikan di industri-industri, khususnya untuk bahan baku yang membutuhkan kondisi asam. Gen yang mengkodekan lipase dari EMP48-D sebelumnya telah dioverekspresikan di dalam inang Escherichia coli BL21, optimasi dilakukan dengan penambahan chaperone dan beberapa jenis vektor. Namun aktivitas lipolitik yang dihasilkan masih rendah. Penyebabnya adalah sebagian besar protein hasil overekspresi termanifestasi dalam badan inklusi, akibat keberadaan sinyal peptida bawaan M. luteus yang tidak dikenali oleh sistem E. coli. Berangkat dari hal tersebut untuk memperbaiki ekspresi gen lipase EMP48-D, dilakukan overekspresi ke dalam inang Pichia pastoris. Strategi pertama yang dilakukan berupa optimasi dengan mengeliminasi sinyal peptida bawaan diganti dengan sinyal peptida alpha mating factor (α-MF) yang telah berada dalam vektor pPICZα-A. Lipase EMP48-D berhasil di ekspresikan dalam bentuk protein ekstraseluler dengan kenaikan aktivitas dua kali lipat dari 15,02 ± 2,33 U mg-1 di E. coli BL21 menjadi 31,01 ± 1,08 U mg-1 di P. pastoris. Strategi kedua dilakukan dengan optimasi preferensi kodon agar lebih dikenali oleh sistem P. pastoris. Konstruksi plasmid rekombinan dilakukan di vektor pPIC9K dan pPICZα-A dan ditransformasikan ke dalam P. pastoris galur KM71 (MutS) dan GS115 (Mut+). Optimasi preferensi kodon berhasil menurunkan jumlah pemakaian kodon dalam bentuk Effective Number of Codons (ENc) dari 30 jenis kodon menjadi 20 jenis kodon. Indeks peluang kemunculan kodon atau Codon adaption index (CAI) ditingkatkan dari 0,408 menjadi 0,995. Analisis susunan nukleotida juga menunjukkan sebanyak 432 pb dari 1260 pb berhasil diganti dengan homologi 65,6% dibandingkan sekuen sebelum optimasi serta kandungan GC direduksi dari 76,5% menjadi 44,7%. Aktivitas lipase EMP48-D meningkat 400% dengan plasmid rekombinan pPIC9K dan inang KM71. Aktivitas spesifik optimal dihasilkan pada pH 5,0 pada suhu 40 °C sebesar 145,41 ± 4,83 U mg-1. Lipase EMP48-D memiliki kestabilan yang baik pada kisaran pH 3,0 – 5,0 dengan aktivitas residual mencapai 86,4% setelah inkubasi selama 180 menit pada suhu 40 °C. Lipase EMP48-D juga mampu menghidrolisis berbagai trigliserida rantai panjang terutama minyak zaitun (100%), diikuti dengan minyak biji bunga matahari (88,5%), minyak kanola (74,4%), minyak jagung (73,1%), minyak bekatul (71,8%), minyak kedelai (69,2%), dan minyak kelapa sawit (42,3%). Lipase EMP48-D toleran terhadap pelarut organik, terutama isopropanol (115,7%), diikuti oleh butanol (114,6%), etanol (102,8%), asetonitril (102,2%), dan metanol (101,6%). Sebaliknya pada pelarut organik n-heksana dan n-heptana terjadi penurunan aktivitas menjadi masing-masing 58,9% dan 83,8%. Konsentrasi 0,01 M ion logam (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn+) menurunkan hingga 43,1% aktivitas enzim sementara pada konsentrasi yang sama FeCl2 (213,8%) dan FeSO4 (136,2%) diketahui mampu meningkatkan aktivitas relatif enzim. Kapabilitas lipase EMP48-D sebagai katalis reaksi transesterifikasi masih rendah, hanya sekitar 2,95% dan 1,06% yang berhasil mengonversi asam lemak bebas menjadi asam lemak metil ester dari substrat palm fatty acid distillate (PFAD) dan fatty matter (FM) dalam pelarut metanol.

Lipases are enzyme that has constantly attracted the attention of industrial sectors. Known as multifaceted applications, lipase is one of the highly demand hydrolytic enzymes. It necessitates to exploration, identification, and development of new lipases with suitable characteristics for industrial needs. EMP48-D lipase is a novel lipase derived from the lipolytic bacteria Micrococcus luteus which has been isolated from tempeh. EMP48-D lipase is active at low pH (acidic lipase), thermotolerant, and stable in various organic solvents. These characteristics make EMP48-D lipase very potential to be developed further, so it can be applied especially in industries that require acidic conditions. The gene encoding lipase from EMP48-D had previously been overexpressed in Escherichia coli BL21, optimization was carried out by adding chaperones and host-vector optimized. However, the expression level obtained was relatively low. This was assumed that overexpression manifested in the inclusion bodies, due to the presence of M. luteus native signal sequence were not recognized by E. coli system. Hence, to improve the expression level the EMP48-D lipase gene was cloned in Pichia pastoris. The first strategy was eliminated the signal sequence and replaced with of alpha mating factor (α-MF) signal sequence that has been within the pPICZα-A vector. EMP48-D lipase was successfully expressed as an extracellular protein with a 2-fold increased activity from 15,02 ± 2,33 U mg-1 in E. coli BL21 to 31,01 ± 1,08 U mg-1 in P. pastoris. Second, the lipase gene was adapted for P. pastoris expression machine according to the preferred codons of P. pastoris, thus it became more recognizable to P. pastoris. Recombinant plasmid constructed in pPIC9K and pPICZα-A vectors and transformed into P. pastoris KM71 (MutS) and GS115 (Mut+) strains. Codon preference optimization was reducing the effective number of codons (ENc) from 30 codons to 20 codons. Codon adaption index (CAI) was increased from 0,408 to 0,995. Sequence analysis also showed that 432 base pairs from 1.260 base pairs was effectively replaced. The new sequence of EMP48-D has 65,6% homologous to sequence before optimization and the GC content was reduced from 76,5% to 44,7%. The codon-optimized EMP48-D lipase has increased by 400% with recombinant plasmid pPIC9K and host KM71. EMP48-D lipase represented specific activity at pH 5,0 and temperature 40 °C was 145,41 ± 4,83 U mg-1. The enzyme has good stability within the pH range 3,0 - 5.0 with 86,4% residual activity after incubation for 180 minutes at 40 °C. EMP48-D lipase was also capable for hydrolyzed various long-chain triglycerides, particularly oil olive (100%) followed by sunflower oil (88,5%), canola oil (74,4%), corn oil (73,1%), rice bran oil (71,8%), soya oil (69,2%), and palm oil (42,3%). EMP48-D lipase was highly tolerance in presence of various organic solvents, such as isopropanol (115,7%), butanol (114,6%), ethanol (102,8%), acetonitrile (102,2%), and methanol (101,6%). Nevertheless, n-hexane and n-heptane decreased their activity to 58,9% and 83,8%, respectively. The 0,01 M concentration of metal ions (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn+) decreased up to 43,1% of enzyme activity while under the same concentration, FeCl2 (213,8%) and FeSO4 (136,2%) indicates increased relative activity of enzymes. The potential of EMP48-D lipase as a catalyst of transesterification reaction was still low, approximately 2,95% and 1,06% have successfully converted into methyl ester fatty acids from free fatty acids of palm fatty acid distillate (PFAD) and fatty matter (FM) substrates in methanol.