Pengembangan Agrobacterium tumefaciens AGL1 Auksotrof dengan Transposon Tn5 untuk Transformasi Tanaman Padi (Oryza sativa L.).

Abstract

Kontaminasi eksplan akibat pertumbuhan berlebih (overgrowth) Agrobacterium setelah tahap ko-kultivasi menjadi masalah yang umum dalam transformasi genetika tanaman berbasis Agrobacterium. Untuk mengatasi hal ini, aplikasi satu atau kombinasi beberapa antibiotik menjadi langkah preventif yang dapat dilakukan. Namun penggunaan beberapa antibiotik dapat mengganggu pertumbuhan dari tanaman. Sehingga dalam penelitian ini, dilakukan pendekatan lain untuk mengontrol overgrowth yakni dengan membuat bakteri auksotrof terhadap asam amino tertentu. Metode yang digunakan dalam membuat bakteri auksotrof adalah dengan teknik mutagenesis transposon. Pendekatan dengan menggunakan transposon sebelumnya telah dilaporkan pada Agrobacterium galur EHA105. Meski demikian, pengujian masih dilakukan pada kultur cair Nicotiana benthamiana, disamping itu belum adanya laporan konstruksi mutan auksotrof menggunakan galur Agrobacterium lain. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi mutan A. tumefaciens AGL1 yang auksotrof terhadap satu jenis asam amino dan menguji efektivitasnya dalam mentrasnfer T-DNA serta kemampuannya dalam menekan overgrowth Agrobacterium di medium seleksi pasca ko-kultivasi. Sebanyak 3315 mutan AGL1 berhasil dikonstruksi dengan memanfaatkan mini transposon Tn5 yang membawa gen resistensi antibiotik spectinomycin (spcR). Hasil penapisan dari 20 mutan putatif auksotrof menunjukkan adanya tiga mutan yang membawa sifat auksotrof terhadap satu jenis asam amino. Ketiga mutan ini adalah AP5-2-51 auksotrof treonina, AP5-5-2 auksotrof sisteina, dan AP5-7-27 auksotrof triptofan. Posisi insersi transposon Tn5 pada genom Agrobacterium dilakukan dengan menggunakan TAIL-PCR. Hasil analisis BLAST menunjukkan posisi insersi terdapat di gen thrB (AAK86584.1; locus tag At1D132_04580) untuk mutan AP5-2-51, sedangkan untuk kedua mutan yang lain tidak berhasil diidentifikasi dengan teknik ini. Uji efektivitas ketiga mutan dalam mentrasnfer T-DNA (pC1300-eGFP-hpt) dilakukan pada eksplan kalus biji padi Nipponbare dengan AGL1 sebagai kontrol. Hasil uji menunjukkan efisiensi transformasi dari ketiga mutan sama dengan AGL1 (Tukey HSD, α= 0.05) dan tidak terganggu dengan keberadaan insersi transposon Tn5. Selain itu, dilakukan pengamatan persentase overgrowth Agrobacterium dari kontrol dan ketiga mutan. Meskipun pertumbuhan Agrobacterium masih terjadi pada keempat kelompok pengujian, tetapi mutan AP5-2-51 menunjukkan perbedaan siginfikan dalam menekan persentase overgrowth (Tuckey's HSD, p <0.05) jika dibandingkan dengan ketiga kelompok pengujian yang lain termasuk galur prototrofnya. Persentase overgrowth antara kontrol dan mutan yakni: 26.25% untuk kontrol (AGL1), 15.56% (AP5-5-2), 12.22 % (AP5-7-27) dan 1.11% (AP5-2-51).