Prospek Pemanfaatan Conditioned Medium dalam Diferensiasi Neuronal Koloni Primer Blastosis Terfertilisasi dan Partenogenetik.

Abstract

Stem cells atau sel punca merupakan sel yang memiliki kemampuan memperbarui diri dan belum berdiferensiasi secara spesifik. Sel ini secara umum terdiri dari sel punca dewasa dan sel punca embrionik. Sel punca embrionik atau embryonic stem cells (ESC) berasal dari perkembangan embrio tahap blastosis. Blastosis hasil fertilisasi sebagai sumber propagasi ESC sayangnya menimbulkan polemik karena embrio merupakan awal dari kehidupan yang baru sehingga penggunaannya dinilai tidak etis. Salah satu alternatif yang kemudian dikembangkan adalah pseudo embryo yang diperoleh melalui metode partenogenesis. Partenogenesis adalah strategi reproduksi tanpa fertilisasi oleh spermatozoa. Partenogenesis secara alami tidak ditemukan pada mamalia, akan tetapi pemahaman mekanisme seluler aktivasi oosit selama proses fertilisasi memungkinkan proses ini dapat dilakukan. Embrio partenogenesis akan gagal berkembang menjadi individu baru dikarenakan hilangnya kontribusi gen-gen spesifik asal paternal akan tetapi dapat dikultur sampai tahap blastosis untuk kemudian dipropagasi menjadi sel punca. Propagasi blastosis menjadi sel punca membutuhkan beberapa tahapan penting. Blastosis dikultur membentuk koloni primer pada tahap pertama. Koloni primer kemudian dipasase dan dilakukan karakterisasi sampai benar-benar stabil memenuhi kriteria ESC. Koloni primer asal blastosis dapat diarahkan untuk berdiferensiasi dengan metode tertentu salah satunya dengan pemanfaatan conditioned medium. Conditioned medium (CM) adalah medium yang berasal dari kultur sel tertentu, khususnya sel punca dan berbagai jenis sel progenitor lainnya, serta mengandung protein-protein yang disekresikan oleh sel dalam bentuk sekretom. Bukti-bukti ilmiah telah menunjukkan bahwa CM bukan hanya limbah biologis tetapi berpeluang untuk dimanfaatkan. Rangkaian penelitian ini dilakukan untuk menguji potensi CM asal sel otak fetus tikus terhadap diferensiasi neuronal koloni primer dari blastosis fertilisasi dan partenogenetik. Penelitian tahap pertama membuktikan bahwa CM asal sel otak fetus tikus E17 mampu menginduksi diferensiasi neuronal dari koloni primer blastosis fertilisasi. Penambahan CM 50% dapat memerantarai pertumbuhan neurit menghasilkan neuron like cells pada hari ke-7 setelah penambahan CM. Proses diferensiasi awal membentuk struktur menyerupai embryoid bodies, kemudian menjadi round shape cells yang memiliki karakteristik sel neuroepitelial atau radial glial, diikuti dengan perpanjangan neurit. Kandungan dalam CM yang berasal dari sekresi sel otak fetus tikus mendorong terjadinya perpanjangan neurit tersebut. Penelitian tahap kedua mengeksplorasi proses produksi CM untuk mengetahui efek heterogenitas sel dan waktu puasa sel serta mengidentifikasi protein-protein yang ada dalam CM. Hasil penelitian kedua menunjukkan bahwa proses kultur tanpa serum atau proses puasa sel akan memengaruhi heterogenitas sel dan profil sekretom. Berdasarkan analisis dari penelitian tahap ini diketahui bahwa CM1 dengan waktu puasa 24 jam didominasi oleh sel neuron immature. Protein yang terkandung dalam CM1 ini berfungsi untuk pengaturan pertumbuhan sel, stimulasi diferensiasi dan produksi energi. Durasi waktu puasa sel yang lebih panjang yaitu 48 jam menyebabkan dominasi astrosit dan sel glia pada populasi sel. Hal ini disebabkan ketahanan sel glia khususnya astrosit terhadap cekaman stres pada kondisi kultur dan daya hidup astrosit lebih tinggi dibandingkan dengan neuron. Sel progenitor yang masih ada juga memiliki tendensi yang lebih tinggi untuk berdiferensiasi menjadi sel glia pada kondisi tanpa serum. Protein yang disekresikan setelah puasa sel 48 jam yang terkandung dalam CM2 merupakan jenis-jenis protein yang disekresikan oleh astrosit dan lebih berperanan dalam proteksi neuron yang masih tersisa. Identifikasi protein dan analisis fungsional mendasari pemilihan CM1 untuk proses induksi koloni primer asal blastosis partenogenetik pada tahap ketiga. Penelitian tahap ketiga dilakukan untuk menganalisis diferensiasi neuronal pada koloni primer asal blastosis partenogenetik dengan CM1 yang diperoleh dari penelitian tahap kedua. Blastosis partenogenetik berhasil diperoleh dengan kultur pada medium bebas fosfat dan mampu membentuk koloni primer meskipun dengan tingkat pembentukan yang lebih rendah dari blastosis terfertilisasi. Hal ini terkait dengan karakter blastosis partenogenetik dengan jumlah sel dan rasio inner cell mass yang lebih rendah dibanding blastosis hasil fertilisasi. Koloni primer dari blastosis partenogenetik masih memiliki sifat pluripotensi dan dapat diinduksi menjadi sel-sel neuronal. Neuron like cells teridentifikasi pada hari ke-7 setelah kultur dengan kombinasi medium neurobasal dan CM1. Penelitian tahap ketiga ini juga mengungkap bahwa CM yang diinaktivasi pada suhu 70°C selama 10 menit tidak mendiferensiasikan koloni primer menjadi sel neuronal dan koloni primer justru tidak berkembang. Hal ini mengonfirmasi peranan kandungan protein dan growth factors serta komponen lain dalam CM pada proses diferensiasi. Rangkaian penelitian tahap pertama hingga ketiga membuktikan bahwa CM memiliki potensi dan prospek untuk dimanfaatkan dalam proses diferensiasi neuronal secara in vitro baik pada koloni primer asal blastosis fertilisasi maupun blastosis partenogenetik. Hasil dari pemanfaatan CM ini diharapkan membuka peluang substitusi growth factor komersial. Hasil ini juga memperkuat hipotesis parakrin dimana sitokin dan growth factor dalam bentuk sekretom yang terkandung dalam CM mendorong terjadinya diferensiasi pada eksperimen in vitro. Penelitian ini juga menunjukkan peluang blastosis partenogenetik sebagai sumber alternatif stem cells meskipun masih diperlukan berbagai optimasi agar efektivitas yang optimal dapat dicapai. Penelitian ini masih terbatas pada uji induksi terhadap koloni primer dan dapat ditingkatkan pada uji terhadap stem cell lines yang telah dikarakterisasi. Hasil penelitian ini dapat diaplikasikan pada laboratorium-laboratorium yang melakukan kultur sel dan menghasilkan CM. Conditioned medium yang selama ini mungkin tidak termanfaatkan dapat diekplorasi potensi penggunaannya untuk mendukung penelitian-penelitian terkait dengan kultur sel khususnya dalam diferensiasi in vitro.