Kajian Penambahan Heparin dan/atau Kafein Terhadap Karakteristik Spermatozoa dan Tingkat Fertilisasi Oosit Sapi secara In Vitro.

Abstract

Fertilisasi in vitro merupakan salah satu tahapan dari proses produksi embrio secara in vitro. Keberhasilan fertilisasi in vitro dapat dioptimalkan dengan cara meningkatkan jumlah spermatozoa yang terkapasitasi. Secara in vitro, kapasitasi dilakukan dengan cara menambahkan senyawa tertentu dalam medium fertilisasi. Heparin dilaporkan dapat meningkatkan kapasitasi, namun tidak menstimulasi terjadinya hiperaktivasi motilitas. Sedangkan kafein selama inkubasi fertilisasi menghambat aktivitas enzim phosphodiesterase sehingga mengurangi kerusakan cAMP serta meningkatkan konsentrasi cAMP intraseluler. Oleh sebab itu, kafein dapat digunakan untuk menginduksi kapasitasi dan hiperaktivasi motilitas spermatozoa. Heparin dan kafein sering ditambahkan secara bersamaan sehingga dapat bekerja sinergis dalam menginduksi kapasitasi, hiperaktivasi motilitas dan meningkatkan jumlah spermatozoa yang berpenetrasi ke dalam oosit. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengevaluasi penambahan heparin dan/atau kafein terhadap tingkat hiperaktivasi motilitas, status kapasitasi dan status reaksi akrosom pada spermatozoa serta tingkat fertilisasi oosit sapi. Spermatozoa yang digunakan yaitu semen beku sapi Brahman yang diperoleh dari Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang, Bandung. Persiapan spermatozoa untuk fertilisasi dilakukan dengan teknik washing pada medium fertilisasi. Semen beku di-thawing dan kemudian dilakukan sentrifugasi. Supernatan dibuang dan pelet disisakan kemudian ditambahkan medium fertilisasi serta dibagi menjadi beberapa kelompok perlakuan. Medium fertilisasi yang digunakan yaitu: (1) medium fertilisasi dasar tanpa ditambahkan kafein dan heparin (kelompok MF), (2) ditambah dengan kafein 2 mM (kelompok MF-Caf-2), (3) ditambah kafein 5 mM (kelompok MF-Caf-5), (4) ditambah heparin 10 g/mL (kelompok MF-Hep-10), serta (5) kombinasi kafein 2 mM dan heparin 10 g/mL (kelompok MF-Caf-2-Hep-10), atau (6) kombinasi kafein 5 mM dan heparin 10 g/mL (kelompok MF-Caf-5-Hep-10). Setiap kelompok perlakuan spermatozoa diinkubasi selama 0, 15, 30 dan 60 menit di dalam medium fertilisasi. Sampel semen dievaluasi terhadap pola gerakan spermatozoa, integritas membran plasma, status kapasitasi dan akrosom. Pola gerakan dievaluasi menggunakan computer-assisted sperm analysis (CASA). Status kapasitasi dan reaksi akrosom diamati menggunakan pewarnaan chlortetracycline (CTC) assay. Integritas membran plasma dievaluasi menggunakan hypoosmotic swelling (HOS) test. Pengamatan viabilitas dengan pewarnaan Eosin-Nigrosin. Fertilisasi in vitro digunakan untuk mengevaluasi kemampuan spermatozoa dari setiap kelompok untuk membuahi oosit secara in vitro. Tingkat fertilisasi dievaluasi dengan menggunakan pewarnaan aceto orcein. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa spermatozoa mengalami hiperaktivasi motilitas ketika diinkubasi dalam medium fertilisasi dengan ditambahkan kafein atau kombinasi heparin dan kafein. Motilitas total dan motilitas progresif spermatozoa pada kelompok MF-Caf-5 tidak mengalami penurunan mulai dari sejak diinkubasi sampai menit ke-60. Sedangkan kelompok MF dan MF-Hep- 10 mulai menurun pada menit ke-30 (P<0.05). Selama enam puluh menit inkubasi, persentase spermatozoa yang belum terkapasitasi dan akrosom utuh (pola F) pada kelompok MF-Hep-10 ditemukan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok lainnya pada menit ke-30 dan menit ke-60 (P<0.05). Persentase spermatozoa yang sudah terkapasitasi dan akrosom utuh (pola B) pada kelompok MF-Hep-10 lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya setelah menit ke-30 sampai menit ke-60 (P<0.05). Kelompok MF-Hep-10 terjadi peningkatan persentase pola B pada menit ke-30 periode inkubasi (P<0.05). Sedangkan kelompok MF, MF-Caf-2 dan MF-Caf-5 tidak ditemukan peningkatan persentase pola B pada periode waktu yang berbeda. Kelompok MF-Hep-10 persentase integritas membran plasma lebih rendah dibandingkan dengan kelompok lainnya (P<0.05). Lebih lanjut persentase integritas membran plasma pada MF-Hep-10 lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan lainnya sepanjang masa inkubasi (P<0.05). Pada periode inkubasi yang sama, kelompok MF-Hep-10 persentase integritas membran plasma lebih rendah dibandingkan dengan kelompok lainnya (P<0.05). Penambahan kombinasi heparin 10 μg/mL dan kafein 5 mM dalam medium fertilisasi menunjukkan motilitas progresif lebih tinggi pada menit ke-60 jika dibandingkan dengan kelompok MF-Caf-2-Hep-10 (P<0.05). Kelompok MF-Caf-2-Hep-10 terjadi penurunan motilitas total, sedangkan pada kelompok MF-Caf-5-Hep-10 tidak terjadi penurunan motilitas total. Setelah 60 menit periode inkubasi, kelompok MF-Caf-2-Hep-10 menunjukkan persentase viabilitas lebih rendah dibandingkan dengan kelompok MF-Caf-5-Hep-10 (P<0.05). Persentase pola F pada kelompok MF-Caf-5-Hep-10 lebih rendah dibandingkan kelompok MF-Caf-2-Hep-10 pada menit ke-30 dan menit ke-60 masa inkubasi (P<0.05). Persentase spermatozoa pada kelompok MF-Caf-5-Hep-10 mengalami peningkatan reaksi akrosom (pola AR) pada menit ke-60 (P<0.05). Setelah dilakukan fertilisasi in vitro diperoleh data bahwa spermatozoa pada kelompok MF-Caf-2-Hep-10 dan MF-Caf-5-Hep-10 menunjukkan tingkat fertilisasi lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok MF-Caf-2, MF-Caf-5 dan MF-Hep-10 (P<0.05). Kelompok MF-Caf-5-Hep-10 memiliki tingkat polispermi lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya (P<0.05). Tingkat fertilisasi mempunyai korelasi positif dengan pola B, sedangkan antara tingkat fertilisasi berkorelasi negatif dengan pola F dan integritas membran plasma (P<0.05). Kesimpulan pada penelitian ini yaitu : (1) penambahan kafein 5 mM pada medium fertilisasi dapat menginisiasi hiperaktivasi motilitas dengan terjadinya penurunan LIN, peningkatan ALH serta peningkatan VCL; (2) spermatozoa yang diinkubasi dengan heparin dapat meningkatkan kapasitasi dan reaksi akrosom dengan ditunjukkan tingginya spermatozoa terkapasitasi dan reaksi akrosom karena terjadi transformasi dari pola F menjadi pola B dan pola AR; (3) kombinasi kafein 5 mM dan heparin 10 μg/mL terjadi peningkatan spermatozoa terkapasitasi (Pola B) dan mengalami hiperaktivasi yang dibuktikan dengan tingginya ALH dan VCL, rendahnya LIN selama inkubasi serta menghasilkan tingkat fertilisasi yang lebih tinggi.