Degradasi Enzimatis Lignoselulosa Oleh Aktinomiset Indigenous: Potensi Penggunaan Lytic Polysaccharide Monooxygenase dalam Pra Perlakuan Limbah Berlignoselulosa

Abstract

Biomassa tumbuhan diproduksi rata-rata sejumlah 200 x 109 ton per tahun dengan kandungan lignoselulosa sebesar 90%, sehingga keberadaan lignoselulosa sebagai komponen utama penyusun dinding sel tumbuhan sangat berlimpah di alam. Selulosa sebagai komponen terbesar dari lignoselulosa, merupakan polimer yang mempunyai struktur linier homogen dari unit glukosil dengan ikatan β(1→4) yang membentuk mikrofibril berstruktur kristalin dan amorf. Ikatan ini diketahui mampu menghalangi aktivitas enzim-enzim hidrolitik pendegradasi lignoselulosa untuk bisa mencapai substratnya sehingga proses degradasi limbah berlignoselulosa biasanya diawali dengan tahap pra perlakuan, seperti misalnya melalui penambahan NaOH. Lytic polisaccharide monooxygenase (LPMO), diketahui mampu memecah polisakarida kristalin melalui aktivitas pemotongan secara oksidatif antara unit β(1→4) glukosil pada selulosa, glukan hemiselulosik dan selodekstrin. Kemampuan LPMO ini sangat mungkin untuk diaplikasikan dalam proses pra perlakuan limbah berlignoselulosa. LPMO memiliki beberapa karakter yakni bersifat Cu-dependent dan dalam aktivitasnya membutuhkan oksigen serta donor elektron yang dapat berasal dari asam askorbat. Kemampuan LPMO dalam meningkatkan aksesibilitas enzim pendegradasi lignoselulosa menimbulkan ide pengujian aktivitas LPMO berdasarkan produk gula pereduksi dengan indikator aktivitas xilanase. Xilanase merupakan enzim pendegradasi xilan (hemiselulosa) yang berperan dalam proses produksi xilitol, etanol, oligosakarida, dan banyak dimanfaatkan dalam industri makanan, pakan ternak, pengolahan pulp serta pemutihan kertas. Aktivitas LPMO juga dapat dideteksi secara kuantitatif berdasarkan analisis produksi hidrogen peroksida (H2O2) yang merupakan produk reaksi samping dari aktivitas LPMO jika tidak terdapat polisakarida. Pelepasan H2O2 dideteksi melalui konversi amplex red ke resorufin oleh horseradish peroxidase (HRP) melalui uji fluorometrik. Berdasarkan latar belakang di atas maka penelitian ini mempunyai tiga tujuan. Pertama, untuk mendapatkan kandidat aktinomiset yang mampu menghasilkan LPMO. Kedua, mendapatkan metode analisis penentuan keberadaan LPMO melalui peningkatan produk gula pereduksi. Ketiga, mengidentifikasi aktinomiset yang berpotensi menghasilkan LPMO. Penelitian ini dimulai dengan isolasi dan pemurnian aktinomiset asal perkebunan kelapa sawit dan Taman Nasional Bukit Dua Belas Jambi. Isolat yang diperoleh kemudiandiuji kemampuan tumbuhnya pada substrat avicel dan uji aktivitas xilanasenya sebagai langkah awal penapisan aktinomiset penghasil LPMO dengan indikator aktivitas xilanase. Isolat aktinomiset dengan kemampuan tumbuh pada avicel dan aktivitas xilanase tertinggi, dipilih untuk diuji kemampuannya dalam menghasilkan LPMO. Identifikasi isolat aktinomiset terpilih dilakukan berdasarkan karakter morfologi, biokimia dan molekuler. Pengaruh ion logam dan donor elektron terhadap aktivitas sinergis antara LPMO dan xilanase pada enzim ekstrak kasar, dieliminasi dengan pengujian pengaruh penambahan ion Cu2+ dan asam askorbat terhadap aktivitas xilanase aktinomiset terpilih. Pengujian aktivitas LPMO diawali dengan produksi LPMO pada media avicel 1% (b/v) selama 10 hari. Waktu inkubasi terbaik yang ditentukan berdasarkan aktivitas LPMO tertinggi dan digunakan sebagai acuan untuk produksi enzim LPMO. Uji aktivitas LPMO berdasarkan produk gula pereduksi dilakukan dengan menggunakan substrat xilan beechwood, carboxymethyl cellulose (CMC) dan avicel dengan penambahan ion Cu2+ dan asam askorbat. Karakter Cu-dependent dari LPMO danalisis dengan uji pengikatan logam melalui penambahan EDTA pada reaksi enzimatis. Pengujian aktivitas LPMO dilanjutkan dengan uji produksi H2O2 menggunakan amplex red fluorometric. Secara berturut-turut Bacillus thuringiensis ATCC 33679 dan Pichia pastoris KM71H penghasil xilanase digunakan sebagai kontrol positif dan kontrol negatif. Uji aktivitas LPMO dalam biodegradasi limbah berlignoselulosa dilakukan dengan menggunakan LPMO dalam proses pra perlakuan batang tembakau dengan perlakuan NaOH sebagai pembanding. Pada perlakuan tersebut juga dilakukan analisis terhadap soluble dan insoluble dietary fiber Isolat aktinomiset S2 yang selanjutnya teridentifikasi sebagai Streptomyces sp. S2 diketahui mempunyai kemampuan tumbuh pada substrat avicel dan aktivitas xilanase yang lebih baik dibanding 4 isolat lain. Ion Cu2+ menghambat aktivitas xilanase dari Streptomyces sp. S2, namun penambahan asam askorbat meningkatkan aktivitas enzim tersebut. Produksi ekstrak kasar LPMO terbaik oleh Streptomyces sp. S2 pada media avicel yang ditentukan berdasarkan produk gula pereduksi tertinggi, terjadi pada waktu inkubasi selama 6 hari yaitu sebesar 276.28±14.41 μg mL-1. Aktivitas xilanase dan CMCase Streptomyces sp. S2, yang diproduksi pada media avicel 1% (b/v), meningkat masing-masing sebesar 2x dan 10x ketika ditambahkan asam askorbat 1 mM. Hasil selanjutnya menunjukkan bahwa kombinasi perlakuan penambahan asam askorbat 1 mM dan ion Cu2+ 0.2 mM pada reaksi enzimatis mampu meningkatkan aktivitas xilanase dan CMCase dari Streptomyces sp. S2 masing-masing sebesar 3x dan 31x. Hasil analisis pada substrat avicel 1% (b/v) menunjukkan bahwa produk gula pereduksi hasil aktivitas ekstrak kasar LPMO dari B. thuringiensis ATCC 33679 dan Streptomyces sp. S2 meningkat masing-masing sebesar 7x dan 3x saat ditambahkan asam askorbat 1 mM pada reaksi enzimatis, namun menurunkan produk gula pereduksi dari aktivitas xilanase P. pastoris KM71H sebesar 40%. Kombinasi perlakuan penambahan asam askorbat 1 mM dan ion Cu2+mM meningkatkan produk gula pereduksi hasil aktivitas ekstrak kasar LPMO dari B. thuringiensis ATCC 33679 dan Streptomyces sp. S2 masing-masing meningkat sebesar 8x dan 5x. Akan tetapi, perlakuan tersebut menurunkan aktivitas xilanase dari P. pastoris KM71H sebesar 59%. Hasil pengujian pengikatan logam menunjukkan bahwa penambahan EDTA 10 mM pada reaksi enzimatis menurunkan produk gula pereduksi sebesar 81%, namun meningkat lagi sebesar 27% ketika dilakukan penambahan ion Cu2+ 0.2 mM. Berdasarkan produksi H2O2 yang dianalisis menggunakan amplex red fluorimetric assay, LPMO dari B. thuringiensis ATCC 33679 mempunyai aktivitas sebesar 0.03 U mL-1, sedangkan aktivitas LPMO dari Streptomyces S2 sebesar 0.02 U mL-1. Uji pra perlakuan menggunakan LPMO dari Streptomyces sp. S2 menghasilkan 1.03% berat kering batang tembakau hasil proses delignifikasi.