Isolasi, Kloning, dan Ekspresi Gen dpe dari Agrobacterium tumefasiens sebagai Gen Penyandi Enzim D-Psicose 3-Epimerase (DPEase).
Abstract
Gula langka atau yang disebut sebagai rare sugar, contohnya D-psikosa,
merupakan gula yang jumlahnya sangat terbatas di alam. D-psikosa memiliki
manfaat dibidang farmasi yaitu untuk menyembuhkan diabetes tipe2. Untuk itu,
D-psikosa memiliki potensi untuk dikembangkan di Indonesia dalam upaya
pengentasan diabetes tipe2. Terbatasnya jumlah D-psikosa menjadi faktor
pembatas dalam pemanfaatannya. Oleh karena itu, dibutuhkan upaya dalam
pengembangan produk D-psikosa.
D-psikosa dapat diperoleh secara enzimatik dengan menggunakan Dpsikosa
3-epimerase (DPEase), yang berfungsi mengubah D-fruktosa menjadi Dpsikosa.
Studi literasi menunjukkan bahwa enzim DPEase yang disandikan oleh
gen dpe dari Agrobacterium tumefaciens memiliki daya konfersi tertinggi untuk
spesifik produk D-psikosa, sehingga enzim DPEase memiliki karakter yang sesuai
untuk diproduksi di Indonesia, sebagai upaya dalam mendukung pengembangan
D-psikosa. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi enzim DPEase
rekombinan dengan cara kloning dan ekspresi gen dpe dari A. tumefaciens asal
Indonesia.
Tahapan penelitian dimulai dari amplifikasi gen dpe dengan teknik
Polymerase chain rection (PCR), dilanjutkan dengan ligasi ke dalam vektor
pGEM®-T Easy dan transformasi ke Escherichia coli DH5α. Koloni positif
dikonfirmasi dengan teknik PCR, pemotongan plasmid dengan enzim restriksi dan
sekuensing. Gen dpe kemudian disubklon ke plasmid pET 21b dan ditransformasi
ke bakteri E. coli BL21 (DE3) untuk proses ekspresi gen. Ekspresi gen dilakukan
dengan induksi 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) dan dianalisis
dengan SDS-PAGE.
Produk PCR gen dpe berukuran 870 bp telah berhasil diperoleh. Hasil
analisa sekuen asam amino dari gen dpe yang diperoleh memiliki tingkat identities
sebesar 96,6% dan similarities sebesar 97,9% dengan asam amino penyusun
enzim DPEase dari A. tumefaciens yang telah dilaporkan. Hasil analisis
kesejajaran meggunakan perangkat lunak bioedit, menunjukkan adanya delapan
perbedaan asam amino yang berada pada posisi basa ke Val50 (valine), Qly53
(Glysin), Thr94 (Therionine), His134 (Histidin), Leu194 (Leusin), Glu196
(Glutamic acid), Val242 (Valin), dan Leu269 (Leucine). Gen dpe telah berhasil di
ekspresikan dan menghasilkan enzim DPEase rekombinan yang berukuran 32 kDa.