Respon Genotipe Hotong [Setaria italica (L.) Beauv.] Toleran dan Peka terhadap Cekaman Kekeringan dan Karakterisasi Gen SiDREB2

Abstract

Cekaman kekeringan merupakan salah satu cekaman abiotik utama yang menghambat produktivitas tanaman di dunia. Hotong (Setaria italica L. Beauv) adalah tanaman penghasil karbohidrat yang relatif toleran terhadap kekeringan. Tingkat toleransi hotong bervariasi antara genotipe. Dengan demikian, studi perbandingan antara genotipe hotong toleran dan peka merupakan salah satu pendekatan untuk mengidentifikasi variabel kunci yang menentukan mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan. Akar adalah organ pertama yang terpapar kekeringan, sehingga respon akar pada level (morfologi, anatomi, fisiologi dan molekuler) perlu diamati. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah (1) untuk mengetahui tingkat toleransi genotipe hotong terhadap cekaman kekeringan, (2) untuk mengamati perbedaan respon akar genotipe toleran dan peka pada level morfologi, anatomi dan fisiologi dan (3) untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen DREB2 dari genotipe hotong dalam respon terhadap cekaman kekeringan. Penelitian ini terdiri atas rangkaian tiga percobaan untuk mencapai tujuan penelitian. Percobaan 1 dilakukan di rumah kaca di Kebun Percobaan Cikabayan (240 m dpl) dari bulan Maret sampai Juni 2016. Enam genotipe hotong, ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, ICERI-7, ICERI-9 dan ICERI-10 ditanam secara hidroponik dalam larutan hara yang mengandung 0 dan 20% PEG selama 2 minggu. Pengamatan kandungan malondialdehid (MDA) dilakukan pada 3 hari setelah perlakuan (HSP), peubah anatomi akar pada 5 HSP, arsitektur akar pada 5, 10 dan 15 HSP, dan pada peubah pertumbuhan pada 15 HSP. Berdasarkan nilai stress tolerance index (STI), genotipe ICERI-5 dan ICERI-6 merupakan genotipe yang lebih toleran terhadap kekeringan dibandingkan dengan empat genotipe lainnya. ICERI-5 adalah genotipe yang memiliki nilai STI tertinggi, sedangkan ICERI-10 adalah genotipe dengan nilai STI terendah. Diameter stele dan jumlah metaxylem akar tidak dipengaruhi oleh cekaman kekeringan (20% PEG) pada genotipe ICERI-5 (toleran), tetapi peubah tersebut mengalami penurunan signifikan pada cekaman kekeringan pada genotipe ICERI-10 (peka). Genotipe ICERI-5 (toleran) juga menunjukkan panjang dan jumlah akar seminal yang lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe ICERI-10 (peka) pada kondisi cekaman (20% PEG). Peningkatan kandungan MDA pada periode awal cekaman (3 HSP) teramati pada genotipe ICERI-5 (toleran), tapi tidak pada genotipe ICERI-10 (peka). Perbedaan respon biokimia, anatomi dan arsitektur akar pada cekaman kekeringan antara genotipe toleran dan peka menunjukkan bahwa karakterkarakter tersebut mungkin menentukan tingkat toleransi terhadap cekaman kekeringan pada hotong. Hasil penelitian pada Percobaan 1 menunjukkan bahwa ICERI-5 adalah genotipe toleran kekeringan, sedangkan ICERI-10 adalah genotipe peka terhadap cekaman kekeringan. Studi perbandingan yang lebih dalam antara dua genotipe tersebut dilakukan pada Percobaan 2. Etilen adalah hormon tanaman yang berbentuk gas yang erat terlibat dalam perkembangan akar tanaman serta respon tanaman terhadap cekaman kekeringan. Arsitektur akar dan kandungan etilen endogen dari dua genotipe hotong tersebut dibandingkan pada Percobaan 2. Percobaan 2 dilakukan di rumah kaca di Kebun Percobaan Cikabayan (240 m dpl) dari Juli hingga Agustus 2016. Percobaan disusun dalam rancangan acak kelompok dengan dua faktor dan tiga ulangan. Faktor pertama adalah dua genotipe hotong, yaitu ICERI-5 (toleran) dan ICERI-10 (peka). Faktor kedua adalah konsentrasi polietilen glikol (PEG-6000), terdiri atas 0 dan 20%. Bibit ditanam selama dua minggu dalam larutan hara yang mengandung PEG dan pengamatan kandungan etilen endogen dan peubah arsitektur akar dilakukan pada 5 HSP. Hasil penelitian menunjukkan bahwa cekaman kekeringan (20% PEG) menyebabkan peningkatan yang signifikan pada kandungan etilen endogen akar ICERI-5 (toleran genotipe), tetapi menurunkan kandungan etilen endogen pada akar ICERI-10 (genotipe peka). ICERI-5 (genotipe toleran) juga menunjukkan panjang akar seminal dan lateral yang lebih tinggi dibandingkan dengan ICERI-10 (genotipe peka) pada 0% maupun 20% PEG. Hasil percobaan 1 dan 2 mengindikasikan bahwa ROS dan etilen terlibat dalam lintasan sinyal pada respon hotong terhadap cekaman kekeringan. Dehydration Responsive Element Binding (DREB) adalah salah satu faktor transkripsi (FT) pada keluarga gen Ethylene Response Factor (ERF) yang terlibat erat dalam respon terhadap cekaman kekeringan pada banyak tanaman. Oleh karena itu, isolasi dan karakterisasi gen homolog DREB2 dari genotipe hotong dengan toleransi yang berbeda terhadap cekaman kekeringan dilakukan dalam Percobaan 3. DNA genom diisolasi dari daun bibit berumur 21 hari setelah semai dari enam genotipe hotong (ICERI-4, ICERI- 5, ICERI-6, ICERI-7, ICERI-9 dan ICERI-10) menggunakan metode CTAB. Amplifikasi PCR menggunakan primer spesifik gen SiDREB2 menghasilkan pita tunggal (±1100 bp). Perunutan sekuen secara langsung dari enam fragmen dan analisis BLAST mengkonfirmasi bahwa fragmen tersebut homolog dengan gen SiDREB2. Akan tetapi, metode perunutan secara langsung tidak bisa membaca runutan sekuen gen secara utuh, fragmenfragmen SiDREB2 disub-dikloning ke pMD20 plasmid dan selanjutnya dilakukan perunutan sekuen. Hasil analisis urutan menunjukkan bahwa gen SiDREB2 dari enam genotipe memiliki panjang 705 pb tanpa intron. ORF menyandikan 234 asam amino yang terletak antara asam amino 7-240. Protein SiDREB2 telah diidentifikasi dalam penelitian ini memiliki 3 domain. Enam genotipe hotong dapat dipisahkan menjadi dua kelompok utama berdasarkan analisis nukleotida pada ORF gen SiDREB2. Konsisten dengan hasil pada percobaan 1 dan 2, genotipe toleran (ICERI-5 dan ICERI-6) dikelompokan bersama, sedangkan genotipe peka (ICERI-4, ICERI-7, ICERI-9 dan ICERI-10) dikelompokkan secara terpisah. Perbedaan satu nukleotida telah berhasil diidentifikasi yang terletak pada basa nomor 558 yang berpotensi dikembangkan sebagai penanda molekuler terkait dengan toleransi kekeringan pada hotong.