Sintesis Lacto-N-Biose I Secara Enzimatis Dari Laktosa Dan Glcnac Menggunakan Enzim Lactose Phosphorylase Dan Lacto-N-Biose I Phosphorylase

Abstract

Lacto-N-biose I (LNB) merupakan salah satu jenis prebiotik yang saat ini telah banyak dikaji khususnya terkait aktivitasnya sebagai bifidus factor. Beberapa penelitian melaporkan bahwa LNB secara signifikan dapat meningkatkan aktivitas mikroflora yang hidup di dalam usus bayi dan balita. Senyawa ini secara alami terdapat di dalam human milk oligosaccharide, akan tetapi seiring dengan perkembangan teknologi, LNB dapat disintesis secara enzimatis. Saat ini, sintesis LNB telah banyak dilakukan, akan tetapi rendemen yang dihasilkan masih rendah dan membutuhkan waktu sintesis yang lama. Oleh karena itu, diperlukan metode yang efisien untuk menghasilkan rendemen tinggi dan dilakukan dengan waktu proses yang singkat. Diketahui bahwa enzim, substrat dan fosfat pada sintesis LNB diyakini dapat mempengaruhi rendemen yang dihasilkan. Pada penelitian ini, dilakukan sintesis LNB secara enzimatis dari laktosa dan GlcNAc dengan menggunakan enzim lactose phosphorylase (LP) dan lacto-N-biose I phosphorylase (LNBP) sebagai katalis. Tujuan penelitian ini yaitu untuk melakukan purifikasi dan karakterisasi enzim LP dan LNBP yang digunakan untuk sintesis LNB. Selain itu diteliti juga pengaruh penambahan enzim, substrat dan fosfat terhadap rendemen LNB yang dihasilkan. Preparasi kultur bakteri dilakukan meliputi transformasi plasmid, pre-kulturisasi dan kulturisasi bakteri. Kemudian dilanjutkan dengan purifikasi enzim dengan menggunakan kromatografi afinitas ion logam imobilisasi seperti: preparasi kolom, pemurnian enzim dan konsentrasi enzim. Setelah itu, dilakukan karakterisasi enzim untuk menentukan aktivitas enzim pada berbagai suhu inkubasi, pH dan konsentrasi substrat. Selanjutnya, dilakukan analisis secara kuantitatif dari sintesis LNB menggunakan high performance liquid chromatography. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum katalisis enzim LP terjadi pada suhu 37oC, pH 6 dengan konsentrasi substrat 15 mM, sedangkan kondisi optimum katalisis enzim LNBP terjadi pada suhu 35oC, pH 7 dengan konsentrasi substrat 10 mM. Aktivitas spesifik enzim LP cukup tinggi (18,64 U/mg), sementara enzim LNBP sangat kecil (0,013 U/mg). Peningkatan konsentrasi enzim LP dan fosfat pada sintesis LNB tidak mempengaruhi rendemen yang dihasilkan, sedangkan konsentrasi substrat berpengaruh nyata terhadap rendemen. Sintesis LNB dari laktosa dan GlcNAc menggunakan enzim LP dan LNBP mampu menghasilkan rendemen hingga 75,3%. Metode ini dapat digunakan sebagai alternatif untuk sintesis LNB dari substrat yang lebih murah yang banyak tersedia di alam.