. Penentuan Konsentrasi Low Melting Point Agarose Dan Lysis Solution Untuk Mendeteksi Kerusakan Dna Spermatozoa Ternak Sapi, Domba, Kambing

Abstract

Deoxyribose-nucleic acid (DNA) merupakan suatu polimer heliks ganda yang terdiri dari nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen; satu basa nitrogen, satu gula pentosa yang disebut deoxyribosa dan satu gugus fosfat. Basa nitrogennya bisa adenin (A), timin (T), guanin (G), atau sitosin (S). Adenin dan guanin adalah purin, basa nitrogen dengan dua cincin organik. Sitosin dan timin adalah anggota famili basa nitrogen yang dikenal sebagai pirimidin yang mempunyai satu cincin tunggal. DNA dapat mengalami kerusakan karena perubahan polimer DNA dan secara terus menerus terpapar pada lingkungan fisik dan kimia yang sangat bervariasi yang berpotensi mengubah struktur alamiah DNA tersebut. Perubahan ini akan memengaruhi proses replikasi dan transkripsi DNA yang mengarah pada kerusakan DNA. Bentuk kerusakan yang lain adalah terputusnya struktur polimer DNA. Pemanasan yang melebihi 37ºC akan menyebabkan terputusnya ikatan glikosida yang menghubungkan basa nitrogen dan struktur gula fosfat sehingga basa nitrogen akan hilang. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan kit deteksi kerusakan DNA spermatozoa ternak yang saat ini masih impor dengan harga yang mahal. Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Pusat Satwa Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Departemen Klinik Reproduksi dan patologi, Fakultas Kedokteran Hewan (FKH) IPB. Semen dikoleksi menggunakan vagina buatan sebanyak dua kali dalam seminggu yang diperoleh dari tiga ekor kambing jantan, tiga ekor domba jantan dan satu ekor sapi FH jantan. Penelitian terdiri dari tiga tahap. Tahap I penentuan konsentrasi low melting point-agarose (LMP-agarose), tahap II penentuan lysis solution (LS), dan tahap III pengujian pewarnaan kromatin DNA spermatozoa. Konsentrasi LMP-agarose yang digunakan adalah 0.6%, 0.7% dan 0.8%. Spermatozoa dan konsentrasi LMPagarose terbaik selanjutnya dilisiskan menggunakan tiga jenis LS. LS I (0.4M Tris, 0.8M DTT, 1% SDS), jenis LS II (0.4M Tris, 2M NaCl, 1% SDS), dan jenis LS III (0.4M Tris-HCl, 2M NaCl, 1% SDS, 0.05M EDTA) pengujian pewarnaan kromatin DNA menggunakan tiga pewarnaan yaitu eosin yellow methylene blue. Kesimpulan penelitian ini adalah konsentrasi 0.6% LMP-agarose merupakan konsentrasi yang dapat digunakan untuk menjebak spermatozoa domba dan kambing bila dibandingkan dengan kedua konsentrasi yang diujikan, sedangkan pada spermatozoa sapi ketiga konsentrasi yang diujikan tidak dapat digunakan. Pada penelitian tahap kedua, lysis solution (LS) yang dapat digunakan untuk melisiskan membran spermatozoa ternak adalah LS III (0.4M Tris-HCl, 2M NaCl, 1% SDS, 0.05M EDTA, pH 7.5), Pewarnaan terbaik menggunakan pewarnaan eosin Yellow dan methylene blue dengan perbandingan 2:1.