Identifikasi Dan Ekspresi Gen Protein Selubung Pepper Vein Yellows Virus Pada Escherichia Coli

Abstract

Penyakit klorosis pada tanaman cabai yang disebabkan oleh Pepper vein yellows virus (PeVYV) anggota dari genus Polerovirus (famili Luteoviridae) telah ditemukan di Indonesia. Berdasarkan hasil survei yang dilakukan pada pertanaman cabai di Desa Kertha, Kecamatan Payangan, Kabupaten Gianyar, Provinsi Bali, tanaman cabai bergejala klorosis banyak ditemukan dalam intensitas tinggi. Tanaman sakit menunjukkan gejala kuning pada lamina, tetapi tulang daun tetap berwarna hijau. Sejauh ini belum tersedia secara komersial antiserum spesifik PeVYV untuk kepentingan deteksi, sehingga upaya membuat antiserum perlu dilakukan. Salah satu teknik terbaru dalam menyediakan sumber antigen untuk pembuatan antiserum ialah melalui teknik molekuler ekspresi gen protein selubung virus pada bakteri kompeten yang sesuai. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi Pepper vein yellows virus (PeVYV) berdasarkan sifat penularan virus menggunakan Aphis nasturtii, bentuk dan ukuran partikel virus, deteksi RNA total dengan reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), perunutan sekuen nukleotida, dan ekspresi gen protein selubung PeVYV pada bakteri ekspresi Escherichia coli. PeVYV dapat ditularkan dari tanaman cabai sakit ke tanaman cabai sehat oleh serangga A. nasturtii (Homoptera: Aphididae). Partikel PeVYV berbentuk heksagonal dengan diameter ~30 nm. RT-PCR menggunakan primer spesifik forward BamHI dan reverse PstI berhasil mengamplifikasi target gen protein selubung PeVYV berukuran ~650 pb. Sekuen gen protein selubung PeVYV isolat Bali, Indonesia memiliki homologi sebesar 99% dengan PeVYV isolat Jepang dan Taiwan. PeVYV berhasil dibuktikan sebagai penyebab penyakit klorosis pada tanaman cabai asal Bali, Indonesia. DNA CP-PeVYV dikloning pada vektor ekspresi pQE30 (Qiagen) pada situs enzim restriksi BamHI dan PstI untuk membentuk plasmid rekombinan pQE30-CP-PeVYV dengan fusi protein putatif. Optimasi ekspresi rekombinan CP-PeVYV dilakukan pada beberapa suhu inkubasi yang berbeda (25, 28, 30, dan 37 oC), konsentrasi akhir Isoprophyl-β-Dthiogalactoside (IPTG) (0.25, 0.5, dan 1 mM) dan waktu panen setelah diinduksi IPTG (3, 6, 9, 12, dan 15 jam). Gen protein selubung PeVYV berukuran ~650 pb diamplifikasi dengan primer spesifik, dikloning pada vektor ekspresi pQE30, ditransformasi, dan dikayakan ekspresi gen tersebut (overexpression) pada bakteri ekspresi E. coli strain M15[pREP4]. Analisis SDS-PAGE menunjukkan rekombinan gen protein selubung PeVYV berhasil terekspresi dengan pita protein putatif berukuran ~25 kDa setelah 6 jam diinduksi dengan 0.5 mM IPTG pada suhu 37 °C, tetapi perlu dioptimasi agar ekspresi gen melimpah. Penyediaan protein selubung PeVYV murni dapat digunakan sebagai imunogen pada tubuh mamalia (kelinci). Antibodi PeVYV yang terbentuk dapat digunakan sebagai bahan deteksi virus yang bersangkutan.