Identifikasi Dan Ekspresi Gen Protein Selubung Pepper Vein Yellows Virus Pada Escherichia Coli
View/ Open
Date
2016Author
Apindiati, Rita Kurnia
Suastika, Gede
Mutaqin, Kikin Hamzah
Metadata
Show full item recordAbstract
Penyakit klorosis pada tanaman cabai yang disebabkan oleh Pepper vein
yellows virus (PeVYV) anggota dari genus Polerovirus (famili Luteoviridae) telah
ditemukan di Indonesia. Berdasarkan hasil survei yang dilakukan pada
pertanaman cabai di Desa Kertha, Kecamatan Payangan, Kabupaten Gianyar,
Provinsi Bali, tanaman cabai bergejala klorosis banyak ditemukan dalam
intensitas tinggi. Tanaman sakit menunjukkan gejala kuning pada lamina, tetapi
tulang daun tetap berwarna hijau. Sejauh ini belum tersedia secara komersial
antiserum spesifik PeVYV untuk kepentingan deteksi, sehingga upaya membuat
antiserum perlu dilakukan. Salah satu teknik terbaru dalam menyediakan sumber
antigen untuk pembuatan antiserum ialah melalui teknik molekuler ekspresi gen
protein selubung virus pada bakteri kompeten yang sesuai. Penelitian ini bertujuan
untuk mengidentifikasi Pepper vein yellows virus (PeVYV) berdasarkan sifat
penularan virus menggunakan Aphis nasturtii, bentuk dan ukuran partikel virus,
deteksi RNA total dengan reverse transcription-polymerase chain reaction
(RT-PCR), perunutan sekuen nukleotida, dan ekspresi gen protein selubung
PeVYV pada bakteri ekspresi Escherichia coli.
PeVYV dapat ditularkan dari tanaman cabai sakit ke tanaman cabai sehat
oleh serangga A. nasturtii (Homoptera: Aphididae). Partikel PeVYV berbentuk
heksagonal dengan diameter ~30 nm. RT-PCR menggunakan primer spesifik
forward BamHI dan reverse PstI berhasil mengamplifikasi target gen protein
selubung PeVYV berukuran ~650 pb. Sekuen gen protein selubung PeVYV isolat
Bali, Indonesia memiliki homologi sebesar 99% dengan PeVYV isolat Jepang dan
Taiwan. PeVYV berhasil dibuktikan sebagai penyebab penyakit klorosis pada
tanaman cabai asal Bali, Indonesia. DNA CP-PeVYV dikloning pada vektor
ekspresi pQE30 (Qiagen) pada situs enzim restriksi BamHI dan PstI untuk
membentuk plasmid rekombinan pQE30-CP-PeVYV dengan fusi protein putatif.
Optimasi ekspresi rekombinan CP-PeVYV dilakukan pada beberapa suhu
inkubasi yang berbeda (25, 28, 30, dan 37 oC), konsentrasi akhir Isoprophyl-β-Dthiogalactoside
(IPTG) (0.25, 0.5, dan 1 mM) dan waktu panen setelah diinduksi
IPTG (3, 6, 9, 12, dan 15 jam).
Gen protein selubung PeVYV berukuran ~650 pb diamplifikasi dengan
primer spesifik, dikloning pada vektor ekspresi pQE30, ditransformasi, dan
dikayakan ekspresi gen tersebut (overexpression) pada bakteri ekspresi E. coli
strain M15[pREP4]. Analisis SDS-PAGE menunjukkan rekombinan gen protein
selubung PeVYV berhasil terekspresi dengan pita protein putatif berukuran
~25 kDa setelah 6 jam diinduksi dengan 0.5 mM IPTG pada suhu 37 °C, tetapi
perlu dioptimasi agar ekspresi gen melimpah.
Penyediaan protein selubung PeVYV murni dapat digunakan sebagai
imunogen pada tubuh mamalia (kelinci). Antibodi PeVYV yang terbentuk dapat
digunakan sebagai bahan deteksi virus yang bersangkutan.
Collections
- MT - Agriculture [3772]