Isolasi dan Pemetaan Gen A36 dari Kedelai (Glycine max (L.)Merryl)

Abstract

Yuniati (2000) telah berhasil mengklon cDNA A36 ke dalam vektor pSport1 pada situs Not1-Sall. cDNA tersebut disintesis menggunakan tehnik RT-PCR (RiverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction), dengan cetakan mRNA dari gen kedelai kultivar Slamet yang diinduksi oleh cekaman 0.6 mM Aluminium (Al) pada pH4, dan telah diisolasi melalui penapisan diferensial. cDNA memiliki urutan nukleotida yang tidak lengkap karena hanya mengandung daerah penyandi saja dan ada kemungkinan merupakan gen yang terpotong. Isolasi dan karakterisasi gen A36 secara utuh dari genom kedelai sangat diperlukan untuk mengetahui urutan nukleotidanya secara lengkap. Regulasi ekspresi dari gen tersebut yang diinduksi oleh cekaman Al akan dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman kedelai sehingga menghasilkan kedelai-kedelai yang toleran terhadap cekaman Al. Isolasi gen A36 dari pustaka genom dilakukan melalui penapisan terhadap pustaka genom kedelai kultivar Slamet dan Lumut menggunakan pelacak cDNA A36. Klon-klon bakteri yang membawa plasmid yang diduga mengandung gen A36 dari kultivar Lumut dan Slamet dianalisis untuk mengisolasi fragmen DNA yang hanya mengandung gen A36 utuh. Melalui pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI dari klon pL4 yang berasal dari kultivar Lumut dan hibridisasi Southern, fragmen berukuran 3.6 kb yang mengandung gen A36 telah berhasil diisolasi. Fragmen tersebut telah disisipkan ke dalam vektor plasmid pSport1 membentuk plasmid rekombinan pL4E dan dimasukkan ke dalam bakteri Escherichia coli galur DH5a. Verifikasi plasmid pL4E menunjukkan bahwa fragmen EcoRI 3.6 kb telah tersisip ke dalam pSport1. Pemotongan ganda plasmid pL4E dengan enzim restriksi yang lain; yaitu: EcoRI-HindIII, EcoRI-BamHI, dan EcoRI-Pstl; dan analisis hibridisasinya menunjukkan bahwa fragmen EcoRI-HindIII 2.7 kb, EcoRI-BamHI 2.9 kb, dan EcoRI-Pstl 2.4 kb mengandung gen A36. Pemetaan fisik plasmid pL4E menunjukkan bahwa fragmen terkecil yang membawa gen A36 adalah fragmen Pstl-HindIII 2.25 kb.