Introduction and Expression of GFP Gene (Green Fluorescent Protein) by Different Promoters on Somatic Embryos of Seaweed Kappaphycus alvarezii

Abstract

Transgenesis is genetic manipulation through gene transfer to introduce the gene coding a protein that encodes a character such as growth, disease resistance, and quality of fish meat or carrageenan content in the seaweed. As an early stage in order to produce transgenic seaweed, this study aims to test the promoter activity and the success of gene transfer of GFP as a marker. Construction of GFP gene with different promoters : CMV (cytomegalovirus), CaMV (cauliflower mosaicvirus), β-actin and keratin was transferred to somatic embryo seaweed by electroporation using a gene pulsher method (BIO RAD) with voltage: 300 V/cm, the pulse length : 0.5 millimeter/second, the pulse number : 4 time, the pulse interval: 0.1 second. Promoter activity was determined by analyzing the gene expression level of GFP using fluorescent microscope. The callus induction of Kappaphycus alvarezii for production of somatic embryos cell by different ratio of growth regulators and agar media concentrations. Callus induction was conducted at 0.8-1.0% agar medium containing IAA : kinetin = 1.0 : 1.0 ppm. Somatic embryos were cultivated by Conway medium (liquid culture). The results showed that CMV promoter drives expresses the number of fluorescent cells on average 34.10±1.49% with moderate and strong intensity levels of luminescence, the CaMV promoter drives luminescence intensity showed strong and percentage fluorescent cells on average 10.48±0.25%. β-actin promoter showed the intensity of luminescence in moderat level and the number of fluorescent cells was 8.85±2.31%, while keratin promoter drives weak luminescence intensity and the average number of fluorescent cells was 4.79± 0.26%. Thus, CMV is the best promoter and production of transgenic seaweed K. alvarezii could be conducted by electroporation method.

Peningkatan produksi budidaya rumput laut dapat dilakukan melalui ekstensifikasi dan penggunaan bibit unggul (tumbuh cepat, tahan penyakit dan perubahan kondisi lingkungan). Permasalahan dihadapi dalam mencapai target produksi adalah rasio tumbuh yang semakin kecil akibat serangan penyakit dan lingkungan yang tidak mendukung. Selain itu, faktor penyakit dan lingkungan mempengaruhi mutu kandungan karaginan. Aplikasi teknologi transfer gen (transgenesis) dengan tujuan seperti peningkatan pertumbuhan, resistensi penyakit dan daya tahan terhadap kondisi lingkungan ekstrim, telah banyak diteliti pada berbagai spesies ikan, tetapi pada rumput laut masih sangat jarang dilakukan. Oleh karena itu perlu dilakukan perbaikan mutu genetik dalam rangka mendukung peningkatan produksi budidaya rumput laut. Salah satu penentu keberhasilan transgenesis adalah kemampuan promoter yang digunakan untuk mengendalikan ekspresi gen yang diintroduksi. Berbagai jenis promoter telah diuji aktivitasnya pada ikan seperti CMV (cytomegalovirus), β-aktin, keratin, sedangkan CaMV (cauliflower mosaicvirus) adalah promoter yang juga dapat aktif baik pada tanaman maupun hewan. Promoter yang telah diisolasi masih sangat terbatas, oleh karena itu perlu dilakukan uji promoter yang ada untuk mengetahui promoter yang sesuai dengan inang yang akan dibuat menjadi transgenik. Pada penelitian ini, sebagai langkah awal produksi bibit rumput laut bermutu tinggi menggunakan teknologi transgenesis, dilakukan introduksi gen GFP sebagai penanda untuk mengetahui aktivitas promoter CMV, CaMV, β-aktin dari ikan medaka, dan keratin dari ikan flounder Jepang. Transfer gen GFP dilakukan menggunakan metode elektroporasi pada embrio somatik K. alvarezii.