Methane Oxidation and Ammonium Accumulation Activity and Characterization of nifH and nifD Genes of Methanotrophic Bacteria from Ricefields

Abstract

Metanotrophic bacteria have ability to oxidize methane. In addition they can fix atmospheric nitrogen, hence this bacterium has the potential role as a nitrogen source provider in the wetland. Nitrogen fixation process is catalyzed by the nitrogenase enzyme complex, encoded by nifH and nifD genes. Characterization these genes would support the use of methanotrophic bacteria in agriculture. Three methanotrophic bacteria isolated from rice fields i.e. BGM1, BGM3, and BGM9 were determined their methane oxidation and ammonium accumulation activities. Methane oxidation activity was analyzed using gas chromatography every two days. The concentration of ammonium in the culture supernatant was measured using phenate method. BGM1 isolate had a high ammonium accumulation rate, it was 2.77 ± 0.75 μmol/mL/day. The highest methane oxidation rate was shown by BGM3 isolate, the rate was 376.79 μmol/mL/day. nifD and nifH genes of three isolates and six other isolates (SS1, SS3, SS10, ST18, SP3 and INP4) were characterized. Based on nifH sequences analysis SS1 isolate was closely related to Beijerinckia mobilis and SS3, SS10, ST 18 isolates were closely related to B. indica subsp. indica ATCC 9039. While BGM3, INP4, and BGM9 isolates were related to nifH of uncultured nitrogen-fixing bacterium. Sequence analysis of nifD gene showed that SS1, SS3, SS10, ST 18 isolates were closely related to B. indica subsp. indica ATCC 9039 and BGM3, BGM9, INP4 isolates were closely related to Xanthobacter autotrophicus Py2

Bakteri metanotrof merupakan bakteri yang mampu menggunakan metan sebagai sumber karbon dan energi untuk pertumbuhannya. Metan tersebut akan dioksidasi menjadi metanol atau dioksidasi lebih lanjut menjadi CO2. Enzim yang berperan dalam oksidasi metan adalah metan monooksigenase (MMO). Selain itu metanotrof tipe II dan tipe X diketahui mampu memfiksasi nitrogen menjadi ammonium, sehingga bakteri metanotrof pemfiksasi nitrogen tersebut juga berperan penting sebagai penyedia sumber nitrogen di lahan sawah. Fiksasi nitrogen dikatalisis oleh kompleks enzim nitrogenase. Enzim tersebut tersusun oleh protein Fe (dinitrogenase reduktase) yang disandikan oleh gen nifH dan protein FeMo (dinitrogenase) yang dikodekan oleh gen nifDK. Gen nifH dan nifD mempunyai sekuen yang conserved terutama gen nifH, sehingga menjadikannya alat molekuler yang ideal untuk mempelajari kemampuan fiksasi nitrogen, distribusi, maupun filogeni bakteri diazotrof. Tiga isolat metanotrof yaitu BGM1, BGM3, dan BGM 9 digunakan sebagai isolat uji untuk mempelajari aktivitas oksidasi metan dan akumulasi ammoniumnya. Aktivitas oksidasi metan dilakukan dengan menghitung konsentrasi gas metan yang ada di headspace menggunakan kromatografi gas setiap dua hari sekali. Sedangkan untuk menghitung konsentrasi ammonium yang terakumulasi di dalam media kultur digunakan spektofotometer pada panjang gelombang 640 nm. Ketiga isolat tersebut mampu mengoksidasi metan selama pertumbuhannya, dan oksidasi metan tertinggi adalah isolat BGM3 sebesar 376.79 μmol/mL/hari. Ketiga isolat tersebut juga mampu memfiksasi nitrogen yang ditunjukkan dengan peningkatan konsentrasi ammonium yang terakumulasi di dalam media. Laju akumulasi ammonium tertinggi pada isolat BGM1 sebesar 2.77 ± 0.75 μmol/mL/hari. Gen nifH dan nifD dari ketiga isolat tersebut dan enam isolat lain (SS1, SS3, SS10, ST18, SP3, dan INP4) kemudian dikarakterisasi. Analisis sekuen gen nifH menggunakan blastX menunjukkan bahwa isolat BGM3, BGM9, dan INP4 berkerabat dekat dengan nifH dari bakteri pemfiksasi nitrogen yang belum bisa dikulturkan, sedangkan isolat SS1, SS3, SS10, dan ST18 berkerabat dekat dengan nifH dari genus Beijerinckia yaitu B. mobilis dan B. indica subsp. indica ATCC 9039. Berdasarkan analisis sekuen gen nifD, isolat BGM3, BGM9, dan INP4 berkerabat dekat dengan nifD dari Xanthobacter autotrophicus Py2, sedangkan isolat SS1, SS3, SS10, dan ST18 berkerabat dekat dengan nifD dari B. indica subsp. indica ATCC 9039. Isolat BGM1, BGM3, dan BGM9 berpotensi untuk diaplikasikan di sawah sebagai pereduksi metan dan juga penyedia sumber nitrogen.