Perancangan Primer untuk Deteksi Fusarium spp.

Abstract

Fusarium is one of the most heterogeneous fungal genera and classification of species within this genus is very difficult. So far, the detection of Fusarium spp. is based on morphological colony and microscopic morphological characteristic such as shape and size of macroconidia and the presence or absence of microconidia and clamydospores. Similarity in one of characteristic of Fusarium spp. species complex can lead to misidentify. Molecular approaches have been developed to support fungal systematic studies, including specific diagnostic by primer of Polymerase Chain Reaction (PCR). DNA fragment size as a result from PCR amplification can used to distinguish fungi from genus until species. This research has a purpose to design PCR primer on 18-28s rRNA region and use it to detect Fusarium spp.. Analysis of forward and reverse primer based on 18-28s rRNA sequences were taken from NCBI. The primer were designed at Primer3. Primer testing were done by PCR amplification. Primer analysis result were named Fus1, Fus2, Fus3, and Fus4. Nine isolates were use in this study are F. graminearum, F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. verticillioides, and F. equiseti. Primer Fus1 and Fus3 amplificate ITS 1 and ITS 2 produce 650 bp amplicon, primer Fus2 amplificate ITS 1 produce 200 bp amplicon, and primer Fus4 amplificate ITS 2 produce 420 bp amplicon. Primer Fus2 was able to amplificate all of the samples, whereas primer Fus1, Fus3, and Fus4 were able to amplificate only six samples

Fusarium adalah salah satu genus cendawan yang paling heterogenus dan klasifikasi berdasarkan morfologi dari spesies-spesies dalam genus ini sangat sulit. Selama ini, untuk mendeteksi dan identifikasi Fusarium spp. dilakukan berdasarkan ciri morfologi koloni dan morfologi mikroskopis seperti bentuk dan ukuran makrokonidia serta ada/tidak ada mikrokonidia dan klamidospora. Identifikasi spesies kompleks Fusarium spp. berdasarkan morfologi, sering menimbulkan kesalahan karena mempunyai ciri morfologi yang sama. Pendekatan molekuler telah dikembangkan untuk mendukung studi sistematika cendawan, termasuk pendeteksian spesifik melalui primer Polymerase Chain Reaction (PCR). Perbedaan ukuran fragmen DNA hasil amplifikasi dengan PCR dapat digunakan sebagai alat untuk membedakan cendawan pada tingkat genus hingga spesies. Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer pada daerah 18-28s rRNA dan menguji primer tersebut dengan PCR untuk mendeteksi Fusarium spp.. Analisis primer forward dan reverse menggunakan urutan nukleotida daerah 18-28s rRNA Fusarium spp. diperoleh dari gene bank National Center of Biology Information (NCBI). Urutan-urutan nukleotida yang terkumpul kemudian disejajarkan dan dibuat rancangan primernya menggunakan Primer3. Hasil analisis primer diberi nama Fus1, Fus2, Fus3, dan Fus4. Isolat-isolat uji yang digunakan pada penelitian ini adalah F. graminearum, F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. verticillioides, dan F. equiseti. Pengujian primer dilakukan dengan mengamplifikasi DNA Fusarium spp. menggunakan PCR. Primer Fus1 dan Fus3 mengamplifikasi daerah Internal Trancribe Spacer (ITS) 1 dan 2 menghasilkan amplikon berukuran 650 pb, primer Fus2 mengamplifikasi daerah ITS 1 menghasilkan amplikon berukuran 200 pb, dan primer Fus4 yang mengamplifikasi daerah ITS 2 menghasilkan amplikon berukuran 420 pb. Primer Fus2 mampu mengamplifikasi seluruh isolat uji, sedangkan primer Fus1, Fus3, dan Fus4 berhasil mengamplifikasi enam isolat.