Teknologi Pengeditan Genom Jeruk Mandarin untuk Peningkatan Ketahanan terhadap Penyakit Huanglongbing

Abstract

Huanglongbing (HLB) merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman jeruk yang disebabkan oleh bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus dan disebarkan melalui vektor serangga Diaphorina citri atau melalui penyambungan dari mata tunas sehat ke batang bawah yang sakit. Penyakit ini menyebabkan pertumbuhan tanaman yang terhambat dengan gejala tanaman menjadi kerdil, daun mengalami klorosis dan berbercak kuning seperti gejala defisiensi hara, serta buah yang berukuran kecil dengan rasa yang pahit dan tidak enak dikonsumsi. Serangan penyakit ini menyebabkan kehilangan hasil antara 30 hingga 100% dengan kerugian ekonomi mencapai miliaran rupiah. Upaya pengendalian paling efektif dari penyakit ini yaitu melalui pemanfaatan varietas jeruk tahan HLB. Namun demikian, hingga saat ini belum diperoleh varietas jeruk komersial, khususnya jeruk mandarin, yang tahan terhadap penyakit ini. Pada saat tanaman jeruk terinfeksi penyakit HLB, bakteri tersebut akan menginduksi jaringan floem tanaman untuk mengakumulasi senyawa pati yang disebut callose, yang biosintesisnya dikendalikan oleh gen callose synthase 7 (CalS7) untuk menghambat laju pergerakan bakteri, namun justru menyebabkan terhambatnya aliran fotosintat dan kerusakan pada jaringan floem. Teknologi pengeditan genom berbasis CRISPR/Cas9 menawarkan alternatif untuk perakitan varietas unggul jeruk tahan Huanglongbing melalui pembungkaman aktivitas gen CalS7. Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahapan percobaan yaitu: (1) Desain dan konstruksi kaset CRISPR/Cas9 yang membawa sekuens gRNA dari gen CalS7 pada jeruk keprok dan siam, (2) Transformasi genetik kaset CRISPR/Cas9-CalS7 menggunakan Agrobacterium tumefaciens pada jeruk keprok dan siam, dan (3) Inokulasi buatan penyakit Huanglongbing terhadap tanaman transforman putatif di rumah kaca. Pada penelitian ini digunakan empat genotipe jeruk mandarin yaitu Keprok Terigas, Keprok Batu55, Siam Madu, dan Siam Pontianak sebagai target utama pengeditan genom. Plasmid pDIRECT_21A, sel kompeten Escherichia coli strain DH5a, maupun sel kompeten Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 dan LBA4404 digunakan pada proses kloning dan transformasi genetik. Pada percobaan pertama, sebuah kaset CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7 telah berhasil dikonstruksi pada penelitian ini menggunakan metode kloning golden gate. Sebuah RNA penuntun (gRNA) terpilih berhasil diperoleh dari sekuens gen CalS7 yang terletak pada lokus orange1.1g022398m berdasarkan informasi dari laman Citrus Genome Database. Hasil verifikasi menggunakan PCR koloni, baik pada plasmid yang diisolasi dari koloni tunggal E. coli maupun A. tumefaciens menunjukkan pita amplikon positif pada ukuran 601 bp sementara hasil digesti menggunakan enzim restriksi HindIII dan KpnI menunjukkan pita amplikon hasil pemotongan pada ukuran 9231 dan 5070 bp. Hasil sekuensing Sanger juga menunjukkan keberadaan sekuens gRNA terpilih pada plasmid rekombinan yang diekstraksi baik dari koloni tunggal E. coli maupun A. tumefaciens. Kaset CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7 tersebut selanjutnya digunakan dalam kegiatan transformasi genetik ke tanaman jeruk keprok dan siam dengan bantuan A. tumefaciens. Pada percobaan kedua diperoleh hasil bahwa media Murashige and Tucker (MT) yang dikombinasikan dengan 1 mg l-1 kinetin menunjukkan jumlah tunas, persentase pembentukan tunas, jumlah daun, jumlah buku, dan tinggi tunas terbaik pada jeruk genotipe Keprok Batu55, Siam Madu, dan Proksi-1 Agrohorti serta dapat digunakan sebagai media multiplikasi tunas pasca transformasi genetik. Pada kegiatan transformasi genetik, sebanyak tujuh tunas hasil transformasi in vitro dan 85 tanaman hasil transformasi in planta generasi T0 menunjukkan pita amplikon positif berdasarkan hasil PCR menggunakan primer spesifik gen Cas9. Hasil sekuensing Sanger menujukkan bahwa mutasi yang diidentifikasi pada ketujuh tunas hasil transformasi in vitro bersifat internal offtarget dengan mutasi berupa SNP yang ditemukan di luar daerah gRNA namun masih berada dalam sekuens gen target. Sementara itu, hasil sekuensing Sanger menujukkan bahwa sebanyak tiga dari 85 tanaman hasil transformasi in planta menunjukkan mutasi yang bersifat on-target dengan mutasi berupa SNP yang ditemukan pada daerah gRNA, namun hanya SNP pada genotipe Keprok Batu55 yang menyebabkan perubahan asam amino. Pada percobaan ketiga diperoleh hasil inokulasi buatan menunjukkan respon ketahanan yang tidak berbeda antara tanaman wild type dengan tanaman jeruk hasil transformasi baik secara in vitro maupun in planta yang ditunjukkan dengan belum terlihatnya gejala visual penyakit HLB pada umur enam bulan pasca inokulasi, pita amplikon negatif berdasarkan hasil PCR menggunakan primer spesifik gen HLB, serta hasil Scanning Electron Microscope (SEM) yang menunjukkan jaringan floem yang bersih tanpa adanya akumulasi senyawa callose baik pada tanaman wild type maupun transforman. Namun demikian, tunas jeruk nipis sebagai kontrol rentan mengalami kematian setelah sebulan pasca inokulasi dengan hasil PCR menunjukkan sebanyak lima dari delapan tunas positif mengandung bakteri HLB. Oleh karena itu, pengamatan lanjutan yang meliputi observasi gejala visual, analisis PCR, dan analisis SEM perlu dilakukan kembali pada dua belas bulan pasca inokulasi untuk memastikan keberadaan bakteri serta melihat ada tidaknya penumpukan callose pada jaringan floem tanaman jeruk transforman yang diujikan.

Huanglongbing (HLB) is one of the crucial diseases in citrus plantation which is caused by Candidatus Liberibacter asiaticus and spread by Diaphorina citri as the vector or via grafting from an infected scion to a healthy rootstock. The disease is promoted by several morphological symptoms such as stunted growth, yellow flush with asymmetrical blotchy mottled leaves which are similar to nutrient deficiencies, and smaller fruit size with bitter taste that is unpleasant for consumption. The pathogen attack caused yield loss ranging from 30 to 100% with economic loss reaching up to billion rupiah. The use of resistant citrus varieties is the most effective way to prevent the infection of this disease. However, all commercial citrus cultivars, especially mandarin citrus, are susceptible to HLB disease. During plant infection, this bacterium induces the production of a starch namely callose in phloem tissue, that is synthesized under callose synthase 7 (CalS7) gene activity, which initially reduces the bacteria’s movement, but ended up with photosynthate flow inhibition and causing the phloem necrosis. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a promising tool to knock-out the activity of this gene in order to assemble new improved citrus varieties with resistance to Huanglongbing. The study was divided into three experimental activities, which consisted of: (1) Design and construction of CRISPR/Cas9 cassette which contained gRNA sequence from the CalS7 gene of keprok and siam citrus, (2) Genetic transformation of CRISPR/Cas9-CalS7 cassette mediated by Agrobacterium tumefaciens to keprok and siam citrus, and (3) Artificial innoculation of HLB disease to putative citrus transformant plants in the greenhouse. A total of four mandarin citrus genotypes, i.e. Keprok Terigas, Keprok Batu55, Siam Madu, and Siam Pontianak, were utilized in this study as the genome editing targets. The pDIRECT_21A plasmid, the competent cell of Escherichia coli strain DH5a, and the competent cell of Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 and LBA4404 were used in the cloning and genetic transformation processes. In the first experiment, a CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7 cassette was successfully assembled using the golden gate cloning method. The selected guide RNA (gRNA) is obtained from CalS7 gene sequence that is located at orange1.1g022398m locus collected from Citrus Genome Database. The verification results from both recombinant plasmid isolated from E. coli and A. tumefaciens revealed positive amplicon at 601 bp, while digestion using HindIII and KpnI enzymes produced targeted amplicon at 9231 dan 5070 bp. Sanger sequencing also detected the existance of a gRNA sequence in the recombinant plasmid which was extracted from E. coli and A. tumefaciens single colonies. The CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7 cassette is subsequently would be transformed into keprok and siam citrus mediated by A. tumefaciens. The second experiment demonstrated that the combination of 1 mg l-1 kinetin with Murashige and Tucker (MT) medium was producing the best number of shoots, percentage of shoot formation, number of leaves, number of nodes, and shoot length in Keprok Batu55, Siam Madu, and Proksi-1 Agrohorti genotypes. Thus, this combination can be used as a shoot multiplication medium post transformation. A total of seven putative transformant shoots from in vitro transformation showed positive amplicon bands and contained Cas9 gene, while as many as 85 putative transformant plants from in planta transformation also revealed the positive amplicon bands. Sanger sequencing results showed the internal off-target mutations outside the gRNA sequence, but still within the targeted gene sequence, that were identified from all the seven shoots from in vitro transformation. Additionally, a total of three in planta transformant plants showed on-target mutations, in the form of SNPs that were detected in the gRNA sequence. However, only one SNP was identified at Keprok Batu55 which caused an amino acid change. In the third experiment, the HLB artificial inoculation showed no resistance difference between the wild type and transformant plants that represented by invisibility of visual symptoms, the negative PCR amplicon using HLB-specific gene primers, and the inexistance of callose accumulation in phloem tissue from both the wild type and citrus transformant plants based on Scanning Electron Microscope (SEM) results. However all the lime shoots that were used as the susceptible control died after a month of inoculation with the PCR results demonstrated the positive amplicons which were identified from five of eight dead shoots, indicating the existance of HLB bacteria. Therefore, the following observations, which include motphological symptom observation, PCR, and SEM analysis should be performed until twelve months post inoculation to ensure the appearance of HLB symptoms in transformant shoots.